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北京地区被检饲料及饲料原料黄曲霉毒素污染情况的调查

北京地区被检饲料及饲料原料黄曲霉毒素污染情况的调查

1, 李笑樱1, 赵丽红1, 贾亚雄2, 计 成1, 马秋刚1, 陈 余2, 王 梁2

1 中国农业大学动物科学技术学院/动物营养学国家重点实验室,北京 1001932 北京市畜牧兽医总站,北京 100107

摘要:【目的】了解目前北京市养殖场所用饲料原料和配合饲料受黄曲霉毒素的污染情况、检出频率和特点,

为饲料生产和养殖企业提供数据参考。【方法】抽样采集北京市21 个养殖场187 份饲料样,采用免疫亲和柱-光化

学衍生-高效液相色谱法测定黄曲霉毒素(B1B2G1 G2)的含量。【结果】玉米、麸皮、豆粕、DDGS、猪配合饲

料和家禽配合饲料中黄曲霉毒素B1 的检出率分别为50.0%46.2%33.3%94.1%67.1%94.3%,平均含量分别

5.980.251.009.832.89 1.06 μg·kg-1,超标率分别为6.2%0.0%0.0%5.9%6.6%0.0%。【结

论】各类饲料不同程度地受到黄曲霉毒素污染,其中AFB1 污染程度较严重;部分配合饲料、玉米和DDGS AFB1

平均含量较高,超标率也较高。

关键词:饲料; 原料; 黄曲霉毒素; 污染

Investigation on Contamination Situation of Aflatoxin in

Detected Feeds and Feedstuffs in Beijing Area

FAN Yu1, LI Xiao-ying1, ZHAO Li-hong1, JIA Ya-xiong2, JI Cheng1, MA Qiu-gang1, CHEN Yu2, WANG Liang2

(1College of Animal Science/National Key Laboratory of Animal Nutrition, China Agricultural University, Beijing 100193;

2Animal Husbandry and Veterinary Station, Beijing 100107)

Abstract: ObjectiveThis study was conducted to analyze and evaluate the contamination situation of aflatoxin in feeds and

feedstuffs in Beijing area. MethodA total of 187 feed samples from 21 farms in Beijing were sampled to detect and quantify the

content of aflatoxin (B1, B2, G1 and G2). An efficient HPLC with post-column photochemical derivatization method was developed,

including immunoaffinity step for aflatoxin extraction from feeds and feedstuffs followed by liquid chromatography (LC) for

quantification. ResultResults showed that the detection rate of AFB1 in corn, bran, soybean meal, DDGS, swine and poultry

complete feeds was 50.0%, 46.2%, 33.3%, 94.1%, 67.1% and 94.3%, the over standard rate was 6.2%, 0.0%, 0.0%, 5.9%, 6.6% and

0.0%, and the average content was 5.98, 0.25, 1.00, 9.83, 2.89 and 1.06 μg·kg-1, respectively. ConclusionThese results indicated

that the average content of aflatoxin in complete feeds, corn and DDGS were the highest. Aflatoxin contamination was widely found

in both feeds and feedstuffs.

Key words: feeds; mycotoxin; aflatoxin; contamination

0 引言

【研究意义】据联合国粮农组织(FAO)估计,全世界谷物供应的25%由于受到真菌毒素污染而不能被食用[1],美国仅畜禽因食用霉菌毒素污染的饲料而使该国畜牧业每年遭受近10 亿美元的经济损失[2]。在

各类霉菌毒素中,危害性最大、毒性最强的是黄曲霉毒素(aflatoxinAFT)。黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等真菌产生的有毒的次级代谢产物[3-4]

24 期 范 彧等:北京地区被检饲料及饲料原料黄曲霉毒素污染情况的调查 5103该类毒素不但可抑制动物免疫机能、降低动物生产性能,甚至死亡,还可在动物产品中残留而威胁人类健康。研究表明,肝癌高发区的地理分布与该地区食物AFT 污染程度呈正相关[5-6]。因此,具体了解饲料原料和饲料受黄曲霉毒素污染的情况、检出频率和特点具有重要意义。【前人研究进展】目前,检测黄曲霉毒素含量的方法主要有薄层色谱法(TLC[7]、酶联免疫法(ELISA[8]和高效液相色谱法(HPLC[9-10]等。张自强等[11]采用酶联免疫法测定了中国11 个省份共计1 013 份饲料样品中黄曲霉毒素B1 含量,发现饲料中黄曲霉毒素B1 的检出率高达99.51%,但超标率较低,平均为2.27%;不同省份饲料中黄曲霉毒素B1 含量差异极显著(P0.01);黄曲霉毒素B1 含量由高到低依次为棉粕、家禽配合饲料、菜粕、玉米、仔猪配合饲料、麦麸、豆粕、鱼粉和小麦。敖志刚[12]评估了2006 2007 年上半年中国饲料原料和全价饲料中6 种主要霉菌毒素的检出水平和分布特点,得出饲料原料和全价饲料中多种霉菌毒素往往同时存在,由于不同毒素间具有协同作用,加剧了毒素的毒性作用和中毒症状的严重程度;副产品原料特别是玉米副产品,如干燥酒糟(DDGS)和玉米蛋白粉中霉菌毒素的污染非常严重。【本研究切入点】目前,已有一些饲料及原料中黄曲霉毒素污染情况的相关调查研究,但采取的检测方法各不相同。HPLC 法虽然具有灵敏度高、稳定性好、准确可靠等优点,但是测定成本较高,需要用到免疫亲和柱,样品量大时鲜有用该方法进行批量测定;另外,同时调查饲料及饲料原料中4 种黄曲霉毒素(B1B2G1 G2)污染情况的研究也较少。【拟解决的关键问题】本研究从北京市不同区县的15 个养猪场及6 个养鸡场分别采集13156 份样品,采用免疫亲和柱-光化学衍生-高效液相色谱法测定样品中黄曲霉毒素的含量,以了解目前北京市畜禽饲养场所用饲料原料和饲料受黄曲霉毒素污染的情况、检出频率和特点,为保障动物健康和食品安全提供理论依据,为广大饲料生产者和动物养殖企业提供数据参考,为加强饲料安全监管以及制定合理的标准提供依据。

1 材料与方法

研究于2011 78 月在北京市郊区(昌平区、大兴区、延庆区、平谷区和顺义区)进行样品采集,室内试验在中国农业大学动物营养学国家重点实验室进行。

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 从北京市的15 个养猪场及6 个养鸡场分别采集了131 56 份样品,其中玉米样品22份;麸皮样品19 份;豆粕样品12 份;DDGS 样品23份;全价配合饲料111 份,包括仔猪料、乳猪料、育

成猪料、育肥猪料、蛋鸡料等。样品中DDGS 来源广泛,分别来自于美国及中国的黑龙江、吉林、辽宁、河南、安徽、四川地区,其它原料和配合饲料产地主要集中在北京、河北、天津地区。采样方法按照《饲料采样方法》(GB/T14699.1-2005[13]要求从可能受污染的区域多次、多点采集具有代表性的样品。每份样品不少于500 g,粉碎过20 目筛,样品在测定前密封保存于-20℃冰箱中。

1.1.2 仪器 岛津SHIMADZU 液相色谱仪

LC-10AT、荧光检测器(岛津RF-20A)、光化学衍生池( AURA USA ) ; 黄曲霉毒素免疫亲和柱AokinImmunoClean CF AFLA),由德国Aokin 司生产。

1.1.3 试剂 黄曲霉毒素混标标准品(B1 1 μg·mL-1B2 0.3 μg·mL-1G1 1 μg·mL-1G2 0.3 μg·mL-1)(Sigma);甲醇,色谱纯;0.01 mol·L-1 PBS 缓冲液(将8 gNaCl0.2 g KCl1.2 g Na2HPO40.2 g KH2PO4 990 mL 蒸馏水中,调节pH=7.0,定容至1 L);去离子水。

1.1.4 色谱条件 参照GB/T 18979-2003[14]黄曲霉毒素测定的色谱条件,并根据试验情况调整,以甲醇-水(5050)为流动相,流速为1 mL·min-1,进样量为20 μL。色谱柱为Dikma C18 色谱柱,4.6 mm×150 mm5 μm。荧光检测器波长:λex 360 nmλem440 nm

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 分别将25 g 磨碎样品和5 g 氯化钠置于250 mL 锥形瓶中,加入100 mL 甲醇水(体积比为82),高速搅拌3 min,静置,过滤。用PBS缓冲液稀释样品,使甲醇含量不得高于10%(如样品混浊,则需再过滤)。

1.2.2 净化 将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取滤液10 mL,注入注射器中。将空气压力泵与注射器相连接,调节压力,使溶液以1 mL·min-1左右的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱

中。加入5 mL10%甲醇水洗涤两次,调节流速为3 mL·min-1 左右,直至空气进入亲和柱中,弃去全部流出液。5104 中 国 农 业 科 学 45

1.2.3 洗脱 准确加入1 mL 甲醇,孵育2 min,流速为1 mL·min-1 左右,收集洗脱液,用于HPLC 析。

1.2.4 黄曲霉毒素标准工作液制备 根据使用需要,准确吸取一定量的黄曲霉毒素标准贮备液(B1 100ng·mL-1 B2 30 ng·mL-1 G1 100 ng·mL-1 G2 30ng·mL-1),用流动相稀释,分别配成系列浓度的标准工作液,如AFB1 的浓度分别为0125 10 ng·mL-14℃保存。

1.2.5 标准曲线的测定 以黄曲霉毒素标准工作液浓度为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,绘制标准工作曲线,用标准曲线对试样进行定量。

1.2.6 回收率和精密度测定 在不含有黄曲霉毒素的空白玉米、麸皮、豆粕和饲料样品中,分别添加3个不同浓度水平(2.0010.00 50.00 μg·kg-1)黄曲霉毒素标准溶液,进行添加回收和精密度试验。每个浓度平行测定5 次,重复5 d,按照本研究中检测方法测定。

1.2.7 数据统计分析 采用Microsoft Excel 进行标准曲线的绘制,运用SAS 8.0 软件中GLM 过程进行单因子方差分析,以P0.05 为显著水平,方差分析显著者采用LSMEANS 过程进行多重比较,试验结果

采用平均数±标准误表示。

2 结果

2.1 方法校正曲线绘制及回收率测定

在使用的色谱条件下,目标物在16 min 内出现峰值。分别以黄曲霉毒素B1B2G1 G2 标准溶液峰面积对浓度做校正曲线,均得到r2=0.999。由1 可知,本检测方法测定黄曲霉毒素的平均回收率为80.28%—85.03%, 日内平均相对标准偏差在1.57%—3.49%, 日间平均相对标准偏差3.47%6.37%。表明此方法的灵敏度和准确度良好,能满足分析的要求。

2.2 样品中黄曲霉毒素的检测

参照中国国家黄曲霉毒素限量标准(GB 13078-2001[15],玉米限量标准≤50 μg·kg-1,豆粕限量标准30 μg·kg-1,仔猪配合料及浓缩饲料限量标准≤10μg·kg-1,生长育肥猪、种猪配合饲料及浓缩饲料限量标准≤20 μg·kg-1,肉用仔鸡前期、雏鸡配合饲料及浓缩饲料限量标准≤10 μg·kg-1,肉用仔鸡后期、生长鸡、产蛋鸡配合饲料及浓缩饲料限量标准≤20 μg·kg-1;参照中国农业行业标准(NY/T 1968-2010[16]DDGS限量标准≤50 μg·kg-1;其余饲料原料参照玉米的判定标准,高于相应允许限量,算作超标。在黄曲霉毒素污染程度判定标准中,轻度污染程度参照限量标准,高于限量标准5 倍剂量的含量为严重污染,两剂量之间为中度污染。


本试验发现,在被黄曲霉毒素污染的样品中,均检出黄曲霉毒素B1,部分检出其它3 种黄曲霉毒素,由此可见,污染饲料原料及配合饲料的黄曲霉毒素主要为AFB1。另外,由于中国饲料卫生标准中,只规定了AFB1 的限量标准,没有关于黄曲霉毒素总量及其它种类黄曲霉毒素的限量规定,无法计算总量超标率,因此本部分将首先对各饲料原料和配合饲料中AFB1 的含量做了超标率和污染程度评判。

北京地区主要饲料原料及配合饲料中黄曲霉毒素B1 4 种黄曲霉毒素(B1B2G1 G2)的检测结果分别见表24

2 被检饲料原料中黄曲霉毒素B1 的含量

同列不同小写字母表示差异显著(P0.05)。下同

Values within the same column with the different small letter are significantly different (P0.05). The same as below

由表2 可以看出,DDGS 中黄曲霉毒素B1 的平均含量显著高于麸皮(P0.05),其它各类饲料原料间毒素含量差异不显著(P0.05)。在被检的DDGS样品中黄曲霉毒素B1 的检出率高达94.1%,玉米、麸

皮和豆粕的检出率分别为50.0%46.2%33.3%。麸皮和豆粕中黄曲霉毒素B1 未见超标,其平均含量分别0.25 1.00 μg·kg-1,属于轻度污染。玉米中黄曲霉毒素B1 的超标率为6.2%,毒素平均含量为5.98μg·kg-1,其最高含量为58.90 μg·kg-1,属于中度污染。

DDGS 中黄曲霉毒素B1 的超标率为5.9%,毒素平均含量为9.83 μg·kg-1,最低含量为0.00 μg·kg-1,最高含量为64.10 μg·kg-1,属于中度污染。

由表3 可以看出,被检配合饲料中,黄曲霉毒素B1 检出率均达到55%以上。其中,大猪料和母猪料中黄曲霉毒素B1 平均含量分别为4.33 5.51 μg·kg-1其最高含量分别为38.29 41.00 μg·kg-1,属于中度污染。其它种类配合饲料未见超标,属于轻度污染。

由表4 可以看出,在被检的样品中,DDGS、猪配合饲料和鸡配合饲料的黄曲霉毒素检出率较高,AFB1 的检出率分别为94.1%67.1%94.3%AFB2的检出率分别为60.9%22.4%48.6%AFG1 的检出率分别为17.4%11.8%14.3%AFG2 的检出率分别为30.4%10.5%34.3%DDGS AFB1 的平均含量显著高于麸皮、豆粕、猪和家禽配合饲料(P0.05),AFG1 的平均含量显著高于麸皮和豆粕(P0.05),AFB2 AFG2 的平均含量显著高于其它组P0.05)。

3 讨论

本试验采用光化学衍生-高效液相色谱法结合免疫亲和柱净化,检测饲料及原料中的黄曲霉毒素。由于免疫亲和柱中的特异抗体对黄曲霉毒素具有专一性,能特效地交联黄曲霉毒素。因此,提取和净化效果良好,样品中杂质少,而且提取速度快,回收率高;且应用光化学衍生池,利用紫外光照射,可解决黄曲霉毒素B1 G1 在水溶液中的荧光淬灭现象。所以,本试验的检测方法比ELASA 试剂盒的检测方法[17-18]

准确、可靠、灵敏度高,较真实地反映了目前饲料及饲料原料中黄曲霉毒素的污染现状。

由以上分析结果可以看出,黄曲霉毒素在被检饲料及饲料原料中均普遍存在。在4 类毒素中,以AFB1的检出率和平均含量最高,污染最为严重;AFB2 仅次AFB1AFG1 AFG2 的检出率和浓度较低。由此

可见,污染饲料原料及配合饲料的黄曲霉毒素主要为AFB1,由于各类毒素均有较强的毒性和致癌性,因此其它3 种黄曲霉毒素的污染情况也不容忽视。


3 被检配合饲料中黄曲霉毒素B1 的含量

4 被检饲料原料及配合饲料中黄曲霉毒素总量B1B2G1 G2的测定

被检饲料原料和饲料中的黄曲霉毒素B1 检出率分别为58.6%74.1%,平均含量分别为5.90 2.31μg·kg-1。敖志刚等[12]2006—2007 年采用酶联免疫法检测中国范围内玉米、蛋白饲料和配合饲料中的黄曲霉毒素含量,检出率分别为82.0%97.2%85.9%平均含量分别为3.147.72 10.64 μg·kg-1。与此相比,本试验的检出率和平均含量偏低,一方面可能是取样代表性差异,也可能因为黄曲霉毒素的污染受气候的影响较大[19-20],南方较北方污染严重;另一方面,可能是所用的检测仪器及检测方法不同,得出的结果不尽相同。同时,由于近年来随着人们对霉菌毒素危害性认识的增强,作物收获后储藏方法的控制,在一定程度上减少了黄曲霉毒素的产生和检出,降低了超标率。尽管如此,由于该类毒素是极强的致癌物质,可引起动物严重的生理病变及对人类造成间接危害,所以对该毒素的监测仍然不容忽视。

从黄曲霉毒素B1 超标率来看,各类饲料有差异,范围为0—13.0%。能量饲料中玉米受污染程度较严重,说明玉米是最易产生黄曲霉毒素的原料之一,该结果与Paterson [21]的报道类似。DDGS 受污染程度

更为严重,超标率为5.9%,最大值为64.10 μg·kg-1张丞等[22]的检测结果也表明,DDGS 霉菌毒素污染程度一般要比玉米严重。原因可能是由于霉菌主要污染玉米的种皮,而DDGS 主要以玉米种皮为主,玉米原料中的霉菌毒素在加工成DDGS 的过程中又被浓缩。

另外,由于DDGS 含水量较高,如果储存不当,非常容易发生霉变。各类配合饲料中黄曲霉毒素B1 检出率均较高。因为配合饲料直接被动物采食,对动物具有直接危害,更能准确客观地反映毒素污染情况,因此建议将配合饲料的检测水平作为主要的检测和监控指标。

调查发现,各类饲料及原料均不同程度地受到黄曲霉毒素的污染,为了减轻霉菌毒素对动物机体的危害,在生产实践中饲料企业和畜禽养殖场可针对性地采取相应措施来减轻和降低毒素的危害。例如,定期

对原料霉菌毒素污染状况进行检测,避免使用污染严重的原料;通过其它营养手段和加强饲养管理,提高动物机体免疫能力和抗病能力;在饲料样品中添加霉菌毒素解毒剂或降解酶[23-25],降低毒素对机体的危害,提高动物生产性能。

黄曲霉毒素的污染一直以来是人们关注的热点,但许多国家的饲料及饲料原料黄曲霉毒素限量标准和污染程度判定标准尚不完整,也不统一。例如,美国规定了饲喂育肥猪的玉米中黄曲霉毒素(B1+B2+G1+

G2)的添加允许量≤200 μg·kg-1,饲喂种猪和成年家禽的玉米中黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)的添加允许量≤100 μg·kg-1,饲喂幼禽及其它动物的饲料及饲料原料中黄曲霉毒素(B1+B2+G1+G2)的添加允许量≤20 μg·kg-1 [26];欧盟制定饲料原料中AFB1 的允许添加限量≤20 μg·kg-1[27]。在中国的饲料卫生标准(GBl30782001)[15]中,只规定了黄曲霉毒素B1 的限量标准,未规定黄曲霉毒素总量和其它种类黄曲霉毒素的允许量。另外,综合其它研究结果发现,同种饲料中不同毒素的超标率会有所不同,并且差异较大,那么如何根据不同指标来综合评价饲料的问题还有待解决。为了避免中国饲料原料标准与配合饲料标准相互冲突,建议相关部门制定、修订、完善饲料产品和相应的饲料原料黄曲霉毒素限量标准,为加强饲料安全的监管、合理控制和限定毒素限量标准提供相关依据。

4 结论

北京地区养殖场被检饲料及饲料原料样品均不同程度地受到黄曲霉毒素污染,其中黄曲霉毒素B1 污染程度较严重,部分配合饲料、DDGS 和玉米受AFB1污染程度均较重。

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(责任编辑 周晓艳)