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北京地区饲料及饲料原料呕吐毒素 污染情况调查

北京地区饲料及饲料原料呕吐毒素污染情况调查

李笑樱,马秋刚1*,谢实勇2,赵丽红1,王梁2,谯仕彦1,计成1,云鹏2

1.中国农业大学动物科学技术学院,动物营养学国家重点实验室,北京100193

2.北京市畜牧兽医总站,北京100107

摘要:本研究旨在了解目前北京市养猪场所用饲料原料和全价饲料受呕吐毒素的污染情况检出频率和特点,为广大饲料生产和动物养殖企业提供基础数据参考采集北京市15 个猪场131 个饲料原料及全价配合饲料,采用免疫亲和柱- 高效液相色谱法测定其中呕吐毒素的含量结果表明:玉米麸皮豆粕DDGS 和配合饲料中呕吐毒素的检出率分别为92.9%92.3%54.5%100%97.4%,平均含量分别为1.010.440.051.36 mg/ kg 0.65mg/ kg,超标率分别为57.1%0.0%0.0%88.2%15.8%结果提示,饲料原料中玉米和DDGS 呕吐毒素平均含量较高,超标率也较高;麸皮豆粕及配合饲料也受呕吐毒素不同程度的污染

关键词:饲料;原料;呕吐毒素;污染

中图分类号:S814.2 文献标识码:B 文章编号:0258-7033201213-0069-04

 

呕吐毒素(Vomitoxin),又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenolDON),属单端孢霉烯族化合物,主要由禾谷镰刀菌(F. graminearum大刀镰刀菌(F.sporotrichioides[1]和梨孢镰刀菌(F. poae)等多种镰刀菌株以及头孢菌属漆班菌属木霉属等菌株代谢产生呕吐毒素的产毒菌株适宜在阴凉潮湿的条件下生长广泛存在于大麦小麦玉米和燕麦中不同动物对呕吐毒素的敏感程度不同,猪是对呕吐毒素最敏感的动物,断奶仔猪尤其敏感饲料中0.3~0.5 mg/kg 的微量毒素就会引起猪拒食生长下降以及对传染病的抵抗力下降,饲料中含1 mg/kg以上的呕吐毒素时可引起猪拒食嗜睡生长严重受阻体增重减慢免疫机能减退肌肉协调性丧失以及呕吐等症状此外,呕吐毒素可在人和动物体内蓄积,具有致畸性神经毒性胚胎毒性和免疫抑制作用[2]有调查显示,中国饲料和原料霉菌毒素污染超标的比例为60%~70%,其中呕吐毒素的超标比例接近70%,但目前相关调查研究和试验数据很有限目前,呕吐毒素的分析测定一般采用薄层色谱法(TLC酶联吸附免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLCTLC 法繁琐费时,灵敏度特异性较差,提取过程中所需有机溶剂品种多且量大,易污染环境,对人体有较大危害,现在已很少采用ELISA 法虽操作简单,灵敏度高,但受试剂盒差异实验温度仪器灵敏度等条件影响较大,重复性差,特异性低,假阳性率高,不能准确定量HPLC 法灵敏度高,重复性好,特异性强而被广泛接受本研究经试验摸索建立了免疫亲和净化- 高效液相色谱- 紫外检测的方法,该方法回收率高重复性好灵敏度高,大大提高了试样的净化效果及检测灵敏度

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂岛津SHIMADZU 液相色谱仪LC- 10AT 及紫外检测器;氮吹仪;呕吐毒素免疫亲和柱(aokinImmunoClean CF DON),由德国Aokin 公司生产呕吐毒素标准品(50 μg/mL)(Tyilogy);甲醇,色谱纯;0.01 mol/L PBS 缓冲液(将8 g NaCl0.2 gKCl1.44 g Na2HPO40.24 g KH2PO4 溶于800 mL 蒸馏水中,调节pH=7.4,定容至1 L);去离子水1.1.2 色谱条件参照GB/T 23503-2009[3]呕吐毒素测定的色谱条件,并根据试验情况调整,以甲醇-水(3070)为流动相,流速为1 mL/min,进样量为20 μL色谱柱为Agilent C18 色谱柱(4.6 mm×150 mm5 μm),紫外检测器检测波长为218 nm

1.2 方法

1.2.1 样品采集2011 78 月,从北京市15 个猪场采集了131 份样品,其中玉米样品14 份;麸皮样品13 份;豆粕样品11 份;DDGS 样品17 份;配合饲料76 份,包括仔猪料乳猪料育成猪料育肥猪料哺乳母猪料等其中DDGS 样品来源广泛,来自于美国黑龙江吉林辽宁河南安徽四川地区,其他原料和配合饲料产地主要集中在北京河北天津地区采样方法按照GB/T14699.1-2005饲料采样方法[4]要求从可能受污染的区域多次多点采集具有代表性的样品每份样品不少于500 g,粉碎过20 目筛,样品在测定前密封保存于-20冰箱中

1.2.2 毒素萃取称取25 g 磨碎样品,置于250 mL锥形瓶中,加入100 mL 甲醇水(体积比为64),以高速搅拌混匀3 min,静置,过滤PBS 缓冲液稀释样品,使甲醇含量不得高于10%,如样品混浊,需再过滤

1.2.3 净化将免疫亲和柱连接于注射器下,准确移取滤液10 mL,注入注射器中将空气压力泵与注射器相连接,调节压力,使溶液以约1 mL/min 左右的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中加入10 mL 10%甲醇水洗涤2 次,调节流速为3 mL/min左右,直至空气进入亲和柱中,弃去全部流出液

1.2.4 洗脱准确加入1 mL 甲醇,孵育2 min,流速为1 mL/min 左右,收集洗脱液40氮气吹干,溶于流动相,用于HPLC 分析

1.2.5 呕吐毒素标准工作液制备根据使用需要,准确吸取一定量的呕吐毒素标准贮备液(10 μg/mL),用流动相稀释,分别配成相当于00.10.215 μg/mL的系列标准工作液,4保存

1.2.6 标准曲线的测定以呕吐毒素标准工作液浓度为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,绘制标准工作曲线,用标准曲线对试样进行定量

1.2.7 回收率的测定对不含有呕吐毒素的空白样品,玉米豆粕麸皮和猪全价饲料进行添加回收和精密度试验样品中添加3 个不同浓度(1.002.002.50 mg/kg)的呕吐毒素标准溶液,每个浓度平行测定5 次,重复5 d,按本方法进行提取净化和检测

1.2.8 统计分析采用Microsoft Excel 进行标准曲线的绘制, 运用SAS 8.0 软件中GLM 过程进行方差分析,以P0.05 为显著水平,P0.01 为极显著水平,方差分析显著者采用LSMEANS 过程进行多重比较,试验结果均以平均值±标准误表示

2 结果与分析

2.1 方法标准曲线绘制及回收率测定在使用的色谱条件下,目标物在5 min 内出峰00.10.215 μg/mL 标准溶液峰面积对浓度做标准曲线,r2=0.999由表1 可知,本检测方法测定呕吐毒素的回收率84.12~89.81%,日内相对标准偏差1.45%~4.36%,日间相对标准偏差3.21%~6.12%表明此方法的灵敏度和准确度良好,能满足分析的要求5 μg/mL 呕吐

毒素标准品(上)和样品色谱图(下)如图1


1 5 μg/mL 呕吐毒素标准品和样品色谱图

 

2.2 样品中呕吐毒素检测结果呕吐毒素限量的判定规则为配合饲料采用我国国家标准B13078.3-

2007[5],猪配合料标准值1 mg/kg,家禽配合料5 mg/kg 判定;玉米,小麦参照我国卫生部颁布的人食用的玉米小麦限量标准1 mg/kg[6]判定;DDGS参照我国农业限量标准1 mg/kg[7];其余饲料原料参照玉米小麦的判定标准,高于相应允许限量,算作超标呕吐毒素污染程度判定标准中,轻度污染程度参照限量标准,严重污染程度参照5 倍限量标准由表2 可以看出,在被检的玉米麸皮和DDGS

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1 呕吐毒素的回收率和精密度


样品中呕吐毒素的检出率均高达90%以上,分别为92.9% bDmLh92.3% 100% 豆粕的检出率较低为54.5%麸皮和豆粕中呕吐毒素未见超标,其平均含量分别为0.44 mg/kg 0.05 mg/kg,属于轻度污染玉米中呕吐毒素的超标率为57.1%,毒素平均含量为1.01 mg/kg,其最高含量为2.13 mg/kg,属于中度污染DDGS 中呕吐毒素的超标率为88.2%,毒素平均含量为1.36 mg/kg,最低含量为0.85 mg/kg,最高含量为1.72 mg/kg,属于中度污染玉米和DDGS 中呕吐毒素的平均含量极显著高于麸皮和豆粕(P0.01),DDGS 中呕吐毒素的平均含量显著高于玉米(P0.05),麸皮中呕吐毒素的平均含量极显著高于豆粕(P0.01

由表3 可以看出,被检配合饲料中呕吐毒素的检出率为97.4%,仔猪料中猪料妊娠母猪料和哺乳母猪料的检出率高达100%其中,乳猪料呕吐毒素未见超标,其平均含量为0.28 mg/kg,显著低于其他种类全价料(P0.05),属于轻度污染仔猪料中猪料大猪料妊娠母猪料和哺乳母猪料均有不同程度的超标,超标率分别为14.3%14.3%22.2%10.0%23.1%,其最高含量分别为2.311.141.441.45 mg/kg1.52 mg/kg,属于中度污染

3 讨论

本试验采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱法

测定呕吐毒素的含量免疫亲和柱净化技术是利用

2 主要饲料原料中呕吐毒素的含量

 

3 被检配合饲料中呕吐毒素的含量

 

注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01下表同

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免疫化学反应原理,采用大剂量的单克隆抗体,选择性吸附提取液中的抗原物质-霉菌毒素由于抗原-抗体反应具有高灵敏高选择高特异性等特点,从而大大地提高了方法的准确度精密度和灵敏度,同时减少了有毒有害试剂的使用,降低了环境污染本试验通过标准曲线和回收率的测定,得到标准曲线的r2=0.999,回收率为84.2%~88.4%,结果表明此方法的灵敏度和准确度良好,可作为呕吐毒素准确定量的检测方法由以上结果可以看出,呕吐毒素在被检饲料及饲料原料中均普遍存在被检饲料原料和饲料中的呕吐毒素检出率分别为87.3%93.1%,王若军等[8]

检测玉米蛋白饲料和配合饲料中的呕吐毒素,检出率分别为100%87%100%,与本试验结果基本一致各类饲料原料和饲料的呕吐毒素超标率有差异,范围为0~88.2%能量类饲料中玉米受污染程度较严重,其超标率为57.1%,平均含量为1.01 mg/kg,该结果与甄阳光等[9]的研究结果基本一致而作为玉米的副产品,DDGS 受污染程度更为严重,超标率为88.2%,平均含量为1.36 mg/kg这可能是由于玉米加工过程中的浓缩效应造成的敖志刚等[10]检测结果也表明由于DDGS 生产过程中对毒素的浓缩效应, 原料中霉菌毒素的污染水平升高Bennett [11]Bothast [12]报道,在DDGS 中特定霉菌毒素含量可以达到原谷物中含量的3 倍左右被检豆粕样品中呕吐毒素的检出率和平均含量最低,这可能是由于其生长期较玉米等能量饲料的生长期短,因此受污染程度较低配合饲料中,乳猪料未见超标,其余种类均有不同程度的超标因为配合饲料直接被动物采食,对动物具有直接危害,更能准确客观地反映毒素污染情况,因此建议将配合饲料的检测水平作为主要的控制指标

虽然呕吐毒素的污染已引起人们的高度重视,但许多国家的饲料及饲料原料呕吐毒素限量标准和污染程度判定标准尚不完整,也不统一如美国制定了饲料用谷物及其副产品(除玉米外)呕吐毒素允许限量5 mg/kg,欧盟制定玉米及其副产品允许限量1.75 mg/kg我国制定了部分配合饲料(如,猪禽及犊牛)中呕吐毒素的限量标准,但未制定饲料原料(除DDGS 外)中呕吐毒素限量标准此外,同一种饲料中不同毒素的超标率会相差较大,如,被检玉米中呕吐毒素的超标率为72.7%,黄曲霉毒素的超标率为2.6%[10],那么用不同毒素的超标率来评定该原料将会得出不同的结论,如何根据不同指标来综合评价饲料的问题还有待解决因此,建议相关部门制定修订完善饲料产品和相应的饲料原料呕吐毒素限量标准,为加强饲料安全的监管提供相关依据

4 结论

被检饲料及饲料原料样品均受呕吐毒素不同程度的污染,其中DDGS 和玉米受污染程度均较重

参考文献:略