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抽样调查北京地区猪场饲料及饲料原料玉米赤霉烯酮污染状况

抽样调查北京地区猪场饲料及饲料原料玉米赤霉烯酮污染状况

雷元培 马秋刚 谢实勇 赵丽红 李笑樱

谯仕彦

1.中国农业大学动物科学技术学院,动物营养学国家重点实验室,北京1001932.北京市畜牧兽医总站,北京100107

要:本研究采用免疫亲和柱高效液相色谱法测定了北京地区猪场饲料原料及全价饲料中玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量,以了解北京地区饲料中ZEN的污染情况。试验抽样采集北京市昌平区、大兴区、延庆区、平谷区、顺义区个区县15个猪场131份饲料样[55份玉米、豆粕、麸皮、干酒糟及其可溶物(DDGS)原料,76份猪全价饲料]进行ZEN含量的测定。结果表明:玉米、豆粕、麸皮、DDGS和全价饲料中ZEN的检出率分别为100.00%54.45%100.00%100.00%58.88%,超标率分别为0.00%0.00%0.00%41.18%0.00%,平均含量分别为109.089.1914.92882.6858.88μg/kg。结果提示,不同饲料原料中ZEN含量存在差异,DDGSZEN平均含量超标,猪全价饲料及玉米、豆粕等饲料原料中ZEN平均含量均未超标。

 

关键词:饲料原料;玉米赤霉烯酮;霉菌毒素;污染

 

基金项目:生猪产业技术体系北京创新团队项目;北京农业国际合作项目

作者简介:雷元培(198—),男,贵州遵义人,博士研究生,从事动物营养和饲料安全研究。Emaillypcau05@126.com

通讯作者:马秋刚,副教授,硕士生导师,Email:maqiugang@cau.edu.cn;计 成,教授,博士生导师,Email:jicheng@cau.edu.cn

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)又称F2毒素,是由田间霉菌镰刀菌产生的一种雌激素类真菌毒素,高温低湿环境下易产生ZEN。ZEN广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦等谷类作物和肉、奶类食品中,具有很强的生殖毒性和致畸作用。动物ZEN中毒使免疫功能受到抑制,生产性能降低,这给畜牧业造成很大的经济损失。因此,ZEN的污染状况和对动物的危害程度备受国内外科研工作者的关注,联合国粮农组织和世界卫生组织早在2002年就已经将解决ZEN问题作为全世界的当务之急[1-2]

美国学者Burlakoti等[3]发现ZEN的检出量在小麦中可高达623~782μg/g,大麦中可高达171~255μg/g。Chin等[4]对亚洲饲料霉菌毒素

污染情况调查表明,ZEN的平均检出量在东亚为396~969μg/kg,东南亚为199~219μg/kg,南亚为76~1182μg/kg。张丞等[5-6]在2008年上半年和2009年对中国饲料和饲料原料中霉菌毒素污染情况进行调查,发现ZEN广泛分布于原料、玉米加工副产物和配合饲料中。杨晓飞等[7]对高温、潮湿的四川地区饲料原料霉菌毒素含量进行分析,发现ZEN在玉米加工副产物(如玉米蛋白粉)、小麦和其他谷物副产品中的最高检出量可达1816.09μg/kg,检出率达74.07%,超标率达14.81%。由此可见,饲料及饲料原料中ZEN的污染广泛而且严重。

目前关于ZEN的检测方法主要有:薄层色谱法(TLC)、酶联免疫法(ELISA)、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)等[8]。由于TLC和ELISA不能准确定量,GC虽然检测灵敏度高,但样品前处理复杂,杂质干扰大。目前对ZEN的检测用HPLC比较认可,用免疫亲和柱对经过萃取的样品进行净化后,杂质少,检出限低。

本课题组经过试验摸索,建立了免疫亲和柱高效液相色谱荧光检测的方法,该方法灵敏度高、回收率高、重复性好。

在所有畜禽动物中,猪对ZEN最为敏感。为了准确评估北京市养猪场所用饲料原料及猪全价饲料中ZEN的污染情况,本研究抽样采集北京市5个区县(昌平区、大兴区、延庆区、平谷区、顺义区)15个代表性猪场(饲养规模大于100头基础母猪)的131份饲料样品[55份玉米、豆粕、麸皮、干酒糟及其可溶物(DDGS)饲料原料和76份猪全价饲料],利用免疫亲和柱高效液相色谱荧光检测法对其中的ZEN含量进行检测,以获取北京市猪场饲料及饲料原料中ZEN含量的基础数据,为广大饲料生产和动物养殖企业提供参考依据。

材料与方法

1.1 试验材料

高效液相色谱仪(SHIMADZU LC-10AT);荧光检测器(SHIMADZURF-20A));色谱柱为AgilentC18色谱柱,5μm,4.6mm×150mm;色谱工作站(威玛龙色谱数据工作站,型号WML2010);ZEN 免疫亲和柱(AokinImmunoCleanCFZEN),由德国Aokin公司生产。

ZEN 标准溶液(250ng/mL)(Supelco,美国);乙腈、甲醇(色谱纯);双蒸水;0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,将8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNaHPO、0.24gKHPO溶于800mL蒸馏水中,

调节pH=7.4,定容至1L)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

于2011年7月至2011年8月,对北京市昌平区、大兴区、延庆区、平谷区、顺义区15个猪场的饲料原料和全价饲料样进行抽样采集,猪场饲养规模均大于100头基础母猪。其中玉米样品14份、麸皮样品13份、豆粕样品11份、DDGS样品17份,全价饲料样品76份(包括乳猪料、仔猪料、中猪料、大猪料、哺乳母猪料、怀孕母猪料等)。其中DDGS样品来源广泛,来自于美国以及黑龙江、吉林、辽宁、河南、安徽、四川地区,其他原料和全价饲料产地主要集中在北京、河北、天津地区。按照GB/T14699.1—2005《饲料采样》[9]的要求从可能受污染的区域多次、多点采集具有代表性的

样品。每份样品不少于500g,将样品粉碎,在测定前密封保存于-20℃冰箱中。

1.2.2 试样制备与提取

1.2.2.1 样品前处理

称取25g磨碎样品,置于250mL锥形瓶中,加入100mL甲醇水(体积比为6∶4),以高速搅拌混匀3min,静置,过滤。用PBS稀释样品,使甲醇含量不得高于10%,如样品混浊,需再过滤。

1.2.2.2 净化

将免疫亲和柱上方塞子取出斜剪断,再插回亲和柱上,上端接上10mL注射器筒。去掉亲和柱下方堵头,弃去柱中保护液。加入10mL滤液过柱,调节流速为1mL/min左右。1.2.2.3 洗脱  液体彻底排净后,加入10mL10%甲醇水洗脱2次,调节流速为3mL/min左右。弃去流出液,最后分2次各加入0.5mL甲醇,分别孵育2min,流速为1mL/min左右,收集洗脱液。

1.2.2.4 毒素的检测

参照GB/T23504—2009《食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》[10]

的ZEN测定方法,并根据试验情况进行调整。试验检测条件确定为:流动相为乙腈∶水∶甲醇(46∶46∶8);流速为1mL/min;进样量为20μL;柱温35℃;外表法定量;检测波长为λex=274nm,λem=440nm;出峰时间7~8min。

1.2.3 标准溶液的配制

根据使用需要,准确吸取一定量的ZEN标准贮备液(250ng/mL),用流动相稀释,分别配成125.000、62.500、31.250、15.625、3.125、1.040ng/mL系列的标准工作液,4℃避光保存备用。

1.2.4 回收率测定

对不含有ZEN的豆粕、玉米、麸皮和猪全价饲料空白样品进行添加回收和精密度试验。样品中添加3 个不同质量分数(2.00、10.00、50.00μg/kg)标准,每个浓度平行测定5次,重复5d,按本方法进行提取、净化和检测。

1.3 数据统计分析

用SAS8.1软件的一般线性模型(generallinearmodel,GLM)程序对所有试验数据进行方差分析,以<0.05为显著水平,方差分析显著者则进行多重比较,结果用平均值±标准误表示。

结果与分析

按照饲料样品中ZEN含量高于检出限算作检出,本研究确定了ZEN的检出限为1μg/kg。我国国家标准GB13078.2—2006《饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量》[11]

规定饲料中ZEN的允许限量是:玉米和配合饲料应500μg/kg,高于相应允许限量算作超标。其余饲料原料参照玉米判定标准。本次试验中ZEN污染程度判定标准,依据文献报道,规定限量标准剂量以下的含量为轻度污染标准,高于限量标准5倍剂量的含量为严重污染标准,两剂量之间为中度污染标准。

2.1 方法校正曲线绘制

在设定的检测条件下,目标物ZEN在7~8min内出峰。以125.000、62.500、31.250、15.625、3.125、1.040ng/mL标准溶液峰面积对浓度做校正曲线(图1),建立一元线性回归方程为=66.982-41.290,=0.9997。

1 ZEN浓度标准曲线

 

2.2 回收率

由表1回收率及精密度数据可以看出,本方

法ZEN回收率数据全部在86.56% ~90.35%,日内相对标准偏差在1.59% ~4.18%,日间相对标准偏差3.58% ~6.75%。以上表明本检测方法的

准确度和精密度良好,能满足分析的要求。

1 ZEN的回收率和精密度

2.3 饲料原料及全价饲料中ZEN的含量

对55份饲料原料ZEN含量的检测结果(表

2)表明,各类原料除豆粕(检出率为54.45%)外,玉米、麸皮、DDGS 中ZEN 的检出率均达100.00%。ZEN 平均含量由高到低依次为DDGS、玉米、麸皮和豆粕,分别为882.68、109.08、14.92和9.19μg/kg。DDGS中ZEN含量显著高于玉米、麸皮和豆粕(<0.05)。DDGS中ZEN的超标率为41.18%,其中中度污染率23.53%,严重污染率17.65%。玉米、豆粕、麸皮中ZEN含量均未超标,属于轻度污染。

饲料原料中ZEN检测结果

平均含量该列数据肩标不同小写字母表示差异显著(<0.05),相同小写字母表示差异不显著(>0.05)。下表同。

Inthecolumnofaveragecontent,valueswithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(<0.05),

whilewiththesamesmalllettersuperscriptsmeannosignificantdifference(>0.05).Thesameasbelow.

由表3可见,所有猪全价饲料中ZEN检出率均达100.00%。猪全价饲料中检测出的ZEN平均含量由高到低依次为哺乳母猪料、中猪料、怀孕母猪料、大猪料、仔猪料和乳猪料,分别为75.60、66.97、62.94、59.01、53.60和39.11μg/kg,各种料之间差异不显著(>0.05),全价饲料ZEN平均含量为58.88μg/kg。所有猪全价饲料ZEN含量均未超标,属于轻度污染。

猪全价饲料ZEN检测结果

检测结果表明,在抽检的55份DDGS、玉米、麸皮和豆粕类饲料原料中,豆粕的ZEN检出率最低,为54.45%,远低于玉米及玉米加工副产物DDGS,这与王若军等[12]、张丞等[6]报道的结果相似。DDGS中ZEN平均含量为882.68μg/kg,超标率为41.18%,其中中度污染率为23.53%,严重污染率为17.65%。张丞等[6,14]和敖志刚等[15]

也报道DDGS中ZEN含量严重超标。这可能是由于DDGS的生产加工过程对毒素的浓缩效应(1t玉米生产乙醇后可以产生330kgDDGS,所以DDGS中霉菌毒素被浓缩成玉米中的3倍)使其毒素含量增加;同时,由于DDGS生产过程中谷物被破碎,霉菌易生长,从而产生较多霉菌毒素。研究还发现来自河南、安徽和四川等沿淮地区以及长江中下游地区的DDGS样品ZEN污染较严重,这可能与上述地区温湿的气候有关[16-17]。本文检测到的玉米中ZEN的平均含量为109.08μg/kg,与王若军等[12]报道的中国饲料原料玉米中ZEN的平均含量值104.99μg/kg十分相近。本试验结果

还表明各个阶段猪全价饲料ZEN 检出率为100.00%,平均含量为58.88μg/kg,远低于国家标准(500μg/kg),均未超标。  目前,许多国家对ZEN限量标准的制订和实施缺乏完整性和统一性。不同国家粮谷和食品中ZEN限量标准不同,一般在50~1000μg/kg之间,如澳大利亚规定谷物中ZEN的含量不能超过50μg/kg,意大利规定在谷物和谷类产品当中ZEN的含量不能超过100μg/kg,而法国规定植物油和谷类当中ZEN的含量必须低于200μg/kg。欧盟规定(EEC253/2004)仔猪和小母猪补充饲料和配合饲料中ZEN的限量为100μg/kg,母猪和育肥猪补充饲料和配合饲料为250μg/kg。我国国家标准GB13078.2—2006《饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量》[11]规定玉米和配合饲料中ZEN 的允许限量应500μg/kg,高于相应允许限量算作超标。标准限量制订和实施的差别与许多因素有关,不同地区气候、饲料类别和畜禽种类及其生理阶段对毒素的分布和敏感性存在差异。霉变的饲料常常会是多种霉菌毒素污染,各种毒素间存在着交互作用。所以如何全面考虑各种因素来制订更科学的毒素限量标准还需进一步研究。

从检测结果看,ZEN在各种原料和猪全价饲料中普遍存在,因此有必要加强ZEN污染的预防和控制。各饲料生产和动物养殖企业应严格检查、监控饲料生产、收获、加工、运输、贮藏和采购等环节。对已经存在毒素的饲料,需采取措施(如物理脱毒、化学脱毒、生物降解等)降低其含量[18]。传统的物理化学脱毒方法(包括氨化法、碱法、高温法、紫外线照射法和渗滤法等)存在效果不稳定、营养成分损失较大以及难以规模化生产等缺点。近几年研究发现,利用微生物或其代谢产物进行生物解毒的方法克服了以上缺点,其中生物酶催化方法因其专一性强、转化效率高等优点越来越受到研究者的关注[19]。未来生物酶制剂的使用将更有效降解饲料中的霉菌毒素,减少饲料中霉菌毒素污染,提高饲料生产和动物养殖者收入。

对北京市5个区县(昌平区、大兴区、延庆区、平谷区、顺义区)15个猪场131份饲料样(玉米、豆粕、糠麸类、DDGS55份,猪全价饲料76份)的ZEN含量进行检测,结果表明:

ZEN在各种原料和猪全价饲料中普遍存在。

玉米、豆粕、麸皮、DDGS和全价饲料中ZEN的检出率分别为100.00%、54.45%、100.00%、100.00% 和58.88%,超标率分别为0.00%、0.00%、0.00%、41.18%和0.00%,平均含量分别为109.08、9.19、14.92、882.68和58.88μg/kg。

抽检DDGS样品ZEN污染严重,其中中度污染率23.53%,严重污染率17.65%。