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百霉解在黄河鲤鱼养殖中应用效果研究

2015-10-11 14:54:02 0人评论 5884次浏览 分类:科技研发

 

                                                                

学位论文

 

霉菌毒素生物降解剂

在黄河鲤鱼养殖中应用效果研究

Application of Biodegrader Supplement in Diet of Yellow River Carp

  

研究      王欣平                     

指导教     计  成  教授              

合作指导教 师:    刘来亭 教授       

申请学位门类级     农业推广硕士       A

专业名     农业(养殖)             

研究方     动物营养                    A

所在学     动物科技学院              A

 

20159

China Agricultural University

Master Thesis

 

 

Application of Biodegrader Supplement in Diet of Yellow River Carp

 

 

Master candidate

Wang Xiping

 

Supervisor

Professor Cheng Ji

 

Co- Supervisor

Professor Laiting Liu

 

 

Major

Animal Nutrition and Feed Science

 

September2015


中 文 摘 要

    本研究以黄河鲤鱼为对象,研究霉菌毒素生物降解剂(BMJ)对饲喂含AFB1饲料的黄河鲤解毒效果。试验选取39.5±0.8g左右黄河鲤750尾,随机分成5个处理,每个处理5个重复,每个重复30尾鱼,试验为期60天;试验分为对照组, AFB1组(负对照组)和试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组,分别投喂基础日粮、含AFB1饲料和加入0.25kg/T0.50kg/T1.0kg/T的霉菌毒素生物降解剂的AFB1饲料。试验结果表明:

 (1)生长性能: 黄河鲤鱼饲喂含50ppb AFB1的饲料后生长性能受到显著影响。在试验3060天时黄河鲤鱼AFB1组肝脏的颜色均为暗黑色,且在30天时肝体比较小,60天时肝体比较大。其中无论在30还是60天时黄河鲤鱼AFB1组的终末体重均较其它组低,但在饵料系数方面却最高。在存活率方面AFB1组最低,但40天以后基本趋于稳定。

(2) 血清抗氧化指标:50ppb AFB1的饲料饲喂黄河鲤鱼后,其血清中总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶的抗氧化活性降低;相反血清中丙二醛的含量则呈现升高的特征。

(3)血清免疫指标:含 50ppb AFB1的饲料可导致黄河鲤鱼免疫指标异常:脾脏指数、溶菌酶LSZ碱性磷酸酶降低

(4)肝脏和肠道酶活指标:50ppb AFB1的饲料可导致黄河鲤鱼鲤鱼肠道和肝胰脏蛋白酶活性、淀粉酶活性和脂肪酶活性在一定程度均有所降低。

(5)消化道微生物指标:50ppb AFB1的饲料可导致黄河鲤鱼消化道大肠杆菌和致病性弧菌增加,芽孢杆菌和乳酸杆菌减少。但对总需氧菌无明显影响。

(6)肝脏与性腺中AFB1残留量:50ppb AFB1的饲料可导致黄河鲤鱼肝脏和性腺中AFB1积累量增加。

(7) 在含有50ppb AFB1的饲料中霉菌毒素生物降解的最佳添加剂量为1Kg/T,可明显改善黄河鲤鱼上述生理生化指标基本恢复或接近对照组的正常水平,在一定程度上消除了AFB1对黄河鲤鱼生理生化指标的不良影响。

…………………

关键词:霉菌毒素生物降解剂(BMJ)AFB1;黄河鲤鱼;解毒

 

ABSTRACT

     In this experiment, the application effects of the commercial biodegrader product(BMJ) in diet of the Yellow River carp was evaluated. Seven hundred and fifty Yellow River carp with average body weight of 39.5 ± 0.8g, were randomly divided into five treatments with five replicates of 30 fish.The feeding trial lasted for 60 days. Test groups included a positive control group feeding positive diet, a negative control group and the three experimental groups feeding negative control diets. The AFB1 contents in positive and negative control diets were 5 and 50 ppb respectively. The supplemented levels of the commercial biodegrader product (BMJ) in three experimental groups were 0.25kg BMJ /T, 0.50kg BMJ /T and 1.0kg BMJ/T respectively. The results showed that:

(1) Growth performance: Yellow River carp feed after feed containing 50ppb AFB1 growth performance is significantly affected. In the color test 30 and 60 days after the Yellow River carp AFB1 livers are dark black, and at 30 days Hepatic body is relatively small, 60 days liver body is relatively large. Which in 30 or 60 days regardless final body weight AFB1 groups were lower than other groups, but in terms of feed conversion ratio was highest. AFB1 was the lowest in survival rates, but 40 days later basically stable.

(2) Serum antioxidant index: feed containing 50ppb AFB1 feeding the Yellow River carp, the antioxidant activity of the serum total antioxidant capacity and total superoxide dismutase reduced; contrary serum malondialdehyde content of the presentation liter high features.

(3) Serum immune parameters: feed containing 50ppb AFB1 Yellow River carp may cause abnormal immune parameters: spleen index, alkaline phosphatase, lysozyme LSZ reduced.

(4) In the liver and intestinal activity indicators: 50ppb AFB1-containing feed may lead to the Yellow River carp carp intestine and liver and pancreas protease activity, amylase activity and lipase activity were decreased to some extent.

(5) Gastrointestinal microbial indicators: with 50ppb AFB1 Yellow River carp feed may cause gastrointestinal E. coli and Vibrio increase, Bacillus and Lactobacillus reduced. But no significant effect on total aerobic bacteria.

(6) The liver and gonads AFBResidues: Includes 50ppb AFB1 Yellow River carp feed may cause liver and gonads increased accumulation of AFB1.

(7) Add 50ppb AFB1 in feed containing BMJ low dose had no significant effect, when a certain dose better;BMJ which can significantly improve the Yellow River carp above the basic physiological and biochemical An amount of 1Kg/T restore or near normal levels in the control group, to a certain extent, eliminate the adverse effects of AFB1 Yellow River carp physiological and biochemical parameters.

Keywords: Mycotoxin biodegrader; AFB1; Yellow River carp; physical and chemical indicators; detoxification

 

目  录

I

第一章    2

研究目的与意义 2

国内外研究进展 2

2.1饲料中常见霉菌毒素 3

2.2 饲料中霉菌毒素的产生 6

2.2.1霉菌的产生条件 6

2.2.2霉菌毒素产生的条件 7

2.3霉菌毒素的危害 8

2.3.1 黄曲霉毒素的危害 8

2.3.2 呕吐毒素的危害: 9

2.3.3 伏马菌素的危害 10

2.3.4 赭曲霉毒素的危害 10

2.3.5 玉米赤霉烯酮的危害: 11

2.4 霉菌毒素之间的相互作用: 12

2.5 霉菌毒素去除方法 12

2.5.1 防霉措施 13

2.5.2 脱毒措施 13

研究内容、方法及技术路线 16

3.1 研究内容 16

3.2 研究方法 16

3.3 技术路线 16

第二章 霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼生长性能的影响 17

1材料与方法 17

1.1 试验材料及试验动物 17

1.2 试验设计 17

1.3 试验日粮 17

1.4 饲养管理 18

1.5 样品采集和检测 18

1.5.1 生长性能指标 18

1.5.2 血清抗氧化指标测定 19

1.5.3 血清免疫指标测定 19

1.5.4 肝脏和肠道酶活指标测定 20

1.5.5 消化道微生物指标测定 20

1.5.6 肝脏和性腺中AFB1残留指标测定 21

1.6 数据统计与分析 21

结果与分析 22

2.1 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肝脏形态颜色和肝体比的影响 22

2.2 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼生长指标的影响 22

2.3 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼存活率的影响 23

2.4  AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼血清抗氧化指标的影响 23

2.5 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对免疫指标的影响 24

2.6 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肠道和肝胰脏消化酶活性的影响 25

2.7 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼消化道微生物菌群的影响 25

2-8 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼消化道微生物菌群的影响          CFU/g 25

2.8 霉菌毒素生物降解剂霉菌毒素生物降解剂对黄河肝脏和性腺中AFB1的影响 26

讨论 27

3.1 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肝脏形态与颜色的影响 27

3.2 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼生长指标的影响 27

3.3 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼存活率的影响 28

3.4 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼血清抗氧化指标的影响 28

3.5 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼免疫指标的影响 29

3.6 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肠道消化酶活力的影响 29

3.7 霉菌毒素生物降解剂和AFB1对黄河鲤鱼肠道菌群的影响 30

3.8 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肝脏和性腺中AFB1积累量的影响 30

结论 31

第三章 本试验主要结论及有待进一步研究的问题 32

本试验的主要结论 32

    2 有待进一步研究的问题

参考文献 33


第一章  绪 论

1 研究目的与意义

    全球范围内每年因霉菌毒素污染而造成的损失非常严重[1]。据联合国粮农组织(FAO)分析报道,全世界每年被霉菌及其毒素污染的谷物占总产量的5%左右,其中遭到严重污染不能被利用而失去使用价值的农作物约有2%[2]。据世界卫生组织(WHO)统计资料分析,全球每年因各种原因而损失的食品和饲料约为其产量的20%上下,其中超过50%是因霉菌及其毒素污染造成的。

    在我国霉菌毒素对食品和饲料的污染也是相当严重的。陈必芳[3]等于1996年通过调研报道,在所检测的饲料中全部被霉菌毒素污染,在所检测的饲料原料仅有少许未被霉菌毒素污染,更有近1/5左右受到严重污染而无法使用。近年来随着监管力度加强,行业标准统一规范,我国饲料和原料中霉菌毒素污染的情况有所降低,有调查显示比例在60%70%之间[4],这种情况较以前稍有些改善,但霉菌毒素污染的情况依然严重。2003年王若军[5]等对来自中国部分省的饲料样品及其原料玉米进行检测发现,全价饲料样品中黄曲霉毒素、赫曲霉毒素、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮的污染普遍存在的,仅在污染程度上有所不同。2012年王金勇[6]等对来至全国421份饲料和原料样品进行检测发现,霉菌毒素对饲料及其原料的污染普遍存在,且存在多种毒素并存的现象。其中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素等为玉米、以及其副产品和饲料中主要的污染毒素。同年周闯[7]等从我国18个省市和地区省市采集多份饲料及其原料样品分析检测发现,霉菌毒素检出率超过60%,超标率近30%;其中受霉菌毒素污染最为严重的是饼粕类。

    饲料和原料中霉菌毒素污染是影响畜禽安全生产的主要因素,含有霉菌毒素的饲料饲喂畜禽后,会造成了畜禽中毒,代谢紊乱,生产能力降低甚至器官的损伤。通过食物链的传递这些含有霉菌毒素的畜产品被人类食用了后会对人类生命健康安全带来直接的危害。霉菌毒素生物降解剂制剂(商品名百霉解),已证明对饲喂含AFB1霉变玉米的蛋鸡以及猪饲料中,在一定程度上改善和缓解了AFB1对蛋鸡和猪的不利影响,目前已经得到推广和应用。但在鱼饲料中应用研究较少。本试验通过研究添加霉菌毒素生物降解剂制剂,对黄河鲤鱼采食含AFB1饲料后解毒效果。为其在生产中利用提供科学依据。

国内外研究进展

霉菌毒素( Mycotoxins),又被称着真菌毒素,是由丝状真菌在代谢营养物质的过程中产生的一类次级代谢产物[8]。霉菌不但本身种类繁多,而且其代谢产物更是多样,但并不是所有的次级代谢产物都是有毒的[9]。霉菌目前已被分离和鉴定能够产生毒素的就有300余种。一般情况下,一种产毒菌株能够产生一种或几种次霉菌毒素,同时一种霉菌毒素又可由不同类型产毒霉菌产生。能够产生毒素的霉菌主要分为六大类:曲霉菌属、链孢霉菌属、青霉菌属、麦角菌属、葡萄穗霉菌属和内生真菌属。

    能够污染饲料的霉菌毒素目前已发现出100多种主要由青霉菌属、曲霉菌属和镰刀菌属霉菌菌株所产的毒素其中污染饲料和原料的对人和动物危害比较严重的主要霉菌毒素有黄曲霉毒素B1Aflatoxin B1AFB1)、 赭曲霉毒素AOchratoxin AOTA)、玉米赤霉烯酮(ZearalenoneZEN)、 烟曲霉毒素(FumonisinFUM)、单端孢霉烯(族)化合物(包括呕吐毒素、雪腐镰菌烯醇及T-2毒素等)以及伏马毒素(Fumonisin)等[10]

2.1饲料中常见霉菌毒素

    (1) 黄曲霉毒素

    黄曲霉毒素(AFT)是化学结构和理化性质特征类似有真菌产生的多种次级代谢产物的集合而绝非单一的一种物质。相似的结构在于都存在一个与基本毒性结构有关的双呋喃环和一个与致癌性有关的氧杂萘邻酮,现在研究者们已发现的黄曲霉毒素有20种左右在常见的且对生物体危害较大的 AFTAFB1AFB2AFG1AFG2四种,以及在牛奶中常见的AFM1AFM2等构成。其中AFM1AFM2是由AFB1AFB2在通过生物体体内代谢的产物,常见AFT化学结构如图1-1AFT是毒性极强的剧毒物质尤其对于肝脏而言,其中以AFB1毒性最强,世界卫生组织( WHO)癌症研究机构在1993年就把其划定为I类天然存在的致癌物[11-15]AFT在紫外线下具有强烈的荧光特性[16,17],样品中的AFT经处理层析在紫外线下AFB1AFB2发出紫蓝色荧光, AFG1AFG2发出黄绿色荧光如表1-1AFT中同属于二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物的AFB1因其空间结构中含有稳定较强的大环的共轨体系对温度耐受好, AFB1在温度高达到268-269℃时才分解,在温度低到-40也很难破坏。通过实验得出:在120℃和0.103MPa 条件下处理 AFB12h仅降解1/4-1/3, 4h降解才达到1/2。一般热处理如烹调和巴氏杀菌以及加工生产过程破坏量微乎其微。

1-1常见AFT的理化性质

黄曲霉毒素

分子式

分子量

熔点()

AFB1

C17H12O6

312

268-269

AFB2

C17H14O6

314

286-289

AFG1

C17H12O7

328

244-246

AFG2

C17H14O7

330

237-240

AFM1

C17H12O7

328

299

AFM2

C17H14O7

330

293

 

1-1常见AFT的化学结构

 

    (2) 呕吐毒素

    呕吐毒素属单端孢霉烯族化合物是脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,缩写DON)[18]的俗称,在1970年研究者从被污染禾谷镰刀菌的玉米中分离出能引起家畜猪呕吐的霉菌毒素,被称之为呕吐毒素[19]。单端孢霉烯族毒素共150多种,DON是其B型化合物,主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)和燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)产生[20],它是污染小麦、玉米、大麦等粮食作物和饲料以及其原料最常见天然霉菌毒素,其纯净物是一种无色针状结晶化学结构如图1-2,具有化学性质稳定,耐热性强的特点。DON的耐储存性很好,在乙酸乙酯(C4H8O2)溶液中可保存较长时间。它对饲粮的污染程度与很多因素有关,其中最关键的因素为湿度,正常条件下防止饲粮中DON的污染,可采取降低其储存条件下的水分就可收到较好效果。

 

 

1-2 DON的化学结构

    (3) 伏马毒素

伏马毒素 (Fumonisin FB) 多见于粮食谷物和饲料中,特别是玉米中最为常见,主要是由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme Sheld)和多育镰刀菌(Fusariumproliferatum)在一定温度和湿度条件下所产生的结构类似的水溶性双酯化合物,它有一个由20个碳原子组成的脂肪链和二个酯键连接的亲水侧链[21]构成。1988Gelderblom[22]等从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马菌素,随后Laurent [23]等又对伏马菌素进行更深层次的分离,得到伏马菌素B( FB1和伏马菌素B2( FB2)。迄今为止,人类已发现了28种伏马毒素及其类似物,根据其R1R2R3R4基团不同的特点而分为ABCP四种不同类型。以上四种类型的伏马毒素中B型在环境中普遍存在,毒性最强,在B型伏马菌素中又包括FB1FB2FB3等,三者中FB1占绝大部分,其毒性也是最强[24-28]FB1在低温18℃时能够稳定储存,但在常温25℃及以上温度时稳定性下降[29]

 

1-3 伏马毒素B1(FB1)

    (4) 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素 (ochratoxins) 主要是由霉菌重的7种曲霉和6种青霉菌产生的一系列结构类似的有毒代谢产物其普遍存在于各种食品、饲料及其他农副产品中,靶器官是人和动物的肾脏。

赭曲霉毒素是由L-β-苯基丙氨酸和异香豆素构成,有ABC四种类型,。其中赭曲霉毒素A (ochratoxin A , OTA) 主要是由曲霉和青霉产生,多生长在粮食产品如小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等、油料作物花生和蔬菜中的豆类等作物上;在赭曲霉毒素中毒性最大、分布最广、产毒量最高、毒性最强、对农产品的污染最重、最容易检出,对人类和动植物影响最大[30]。它是由异香豆素衍生物和苯丙氨酸构成[31],化学名称为7-羧基-5-氯代-8-羟基-3,4-二氢化-3R-甲基异氧杂奈邻酮,分子式为C20H18CLNO6化学结构见图1-4,在焙烤条件下使其毒性只能减少到80%,一般条件下的蒸煮对其毒性不构成破坏作用[32-34];在紫外线照射下其最大吸收峰为333nm呈现绿色荧光。

1-2 赭曲霉毒素ABC的性质

名称

分子式

分子量

熔点()

LD50(mg/kg)

ochratoxin A

C20H18CLNO6

403

169

20-22

ochratoxin B

C20H19NO6

370

221

ochratoxin C

C22H22CLNO6

431

 

1-4 赭曲霉毒素ABC化学结构

 

    (5) 玉米赤霉烯酮毒素

玉米赤霉烯酮(zearlenoneZEN)又称F-2毒素,是非类固醇类物质的但却具有类雌激素作用的霉菌代谢毒素,受毒素剂量和作用时间的影响能造成动物急慢性中毒,可导致动物繁殖能力异常严重者直接死亡;粉红镰刀菌(Fusariumroseum)及禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是其主要的产毒菌株[35]。其广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、大麦等谷类作物以及牛奶中[36],分子式为C18H22O5,相对分子质量为318,结构见图1-5

 

1-5玉米赤霉烯酮化学结构

2.2 饲料中霉菌毒素的产生

2.2.1霉菌的产生条件

霉菌属于微生物的一种,种子或孢子为其繁衍下一代的主要方式。在干燥的环境中,很难通过肉眼察觉,但会以孢子方式存在,在收获时、贮存期间或在饲料加工的过程中在环境条件适宜的情况下开始萌发生长和产毒。特别是在我国南方56月份的霉雨季节更易于这些霉菌生长繁殖。霉菌按其生长环境一般可分为仓贮性霉菌和田间霉菌2类。其中在大田作物上能够产生霉菌毒素的称为“大田毒素”;在贮存过程中能够产生的毒素的称为“贮存毒素”,同时有些霉菌既可以在大田作物上产生霉菌毒素,又可以在贮藏过程中产生毒素。霉菌按其毒素产生的条件大致可分为三种类型:①全天产毒型,如玉米赤霉烯酮这类霉菌产生毒素和产毒量受环境条件的影响差异不大;②高温产毒型:在我国南方温度较高的地区易于产毒,如黄曲霉毒素;③低温产毒型:在我国气温较低的中部和高纬度地区的温带或凉湿地区均可以产毒,如单端抱霉烯族毒素和赭曲霉毒素等。当然这有些霉菌同时属于多种类型,如单端抱霉烯族毒素既属于全天产毒型又属于低温产毒型。霉菌产生毒素的这种特性,也是是造成全球不同地区饲粮中霉菌毒素种类和含量差异化存在的根本因素[37-40]

2.2.2霉菌毒素产生的条件

    霉菌是自然生成的种类较为繁多的微生物,其在一定的环境条件下才能够产生毒素。在条件适宜的情况下,产毒量就会增加,否则产毒会减少。在种类繁多的霉菌中只有一部分菌株可产生毒素,同一菌株的产毒又表现出可变性与差异性,这与该菌株的生长环境条件息息相关,如饲料中营养成分组成、贮藏环境中的温度与湿度等。同一菌株往往可产生多种毒素,且同一毒素也可由多种霉菌菌株产生;即便是不产生毒素的霉菌,如果在饲粮中广泛存在繁殖也会造成饲粮营养价值的降低[41-43]。影响饲粮中霉菌产生毒素的主要因素包括温度、湿度、氧气、pH值以及营养物质等。 温度是决定霉菌生长和产毒的重要因素。危害饲料的霉菌大多数属于中温型真菌在4~60的条件下均可以生长繁殖,但不同类型霉菌产毒最佳温度亦各不相同,一般霉菌最适宜产毒温度往往比其适宜生长温度略低一些,如曲霉和青霉的最适生长温度分别为23-34℃和20-35℃,在营养条件较差的情况下更偏向于产毒而不是生长繁殖。其中霉菌菌株产生黄曲霉毒素的温度一般在11-37之间,37时只产生AFB1[44,45]。 湿度是影响霉菌生长和产毒的又一重要因素。与细菌相比,霉菌的生长和产毒对湿度的要求较低,饲料中的霉菌可以在较低湿度的环境中生长。如收获的小麦储藏在相对湿度63%、其中水分含量在低于14%的环境中基本不会霉变产毒;而当霉菌处在高水分含量条件下时,又会因营养物质吸收不良而影响生长。正常情况下,饲粮中常见的产毒霉菌的生长与其所在的环境湿度成正相关,在一定范围内较高的湿度霉菌的生长也较快,同时霉菌产生毒素也需要有与之相适应的环境湿度。在产黄曲霉毒素的霉菌中生长产毒的相对湿度需要高于83%,若此时环境的温度、pH、营养因子等条件均不是霉菌产毒所适宜的,此时霉菌对相对湿度的要求会更苛刻方能产毒[46-48]。一般而言,饲粮中的水分在17%-18%时霉菌较易产毒,根据这种情况对饲粮及时晾晒是防止其霉变的简单有效方法。同时对于霉菌产毒温度和湿度之间还存在着相互关联,如在霉菌处在水分适宜的条件下,其产毒对温度的要求较为宽松。霉菌的生长受环境中pH的影响较小,但产毒对pH的较高,大多数霉菌在酸性环境中才能产毒,而饲粮的pH正在这一范围内。霉菌产生毒素所需的pH值同时也受到生长环境中营养因子等因素的制约[49,50]。 霉菌生长繁殖和产毒都离不开各种营养因子,首先霉菌的生长所需的碳源和氮源必须从外部获得,在高含糖量和高蛋白质的基质中较有利于黄曲霉毒素的产生,同时饲粮中含1%~3%的食盐会更有利黄曲霉毒素的产生[51],饲粮中的各种微量元素也对霉菌产生毒素有一定的影响。水分含量为17%~18%时是霉菌生长繁殖与产毒的最佳条件[52]。由于霉菌种类繁多,其所需最适产毒的水分含量也千差万别,如产赭曲霉毒素的赭曲霉在16%以上,产黄曲霉毒素的黄曲霉与多种青霉为17%以上。饲粮的储藏环境也会影响饲粮中的的含水量,这是因为在储藏过程中,饲粮中的水分会与环境中的水分达到动态平衡;在储藏环境中,粮食类的大米、小麦类中的平衡水分为14%以下,大豆中平衡水分为11%以下时,抑制了霉菌的生长繁殖和产毒。饲粮中的水分含量是决定霉菌生长产毒的重要条件,但起决定作用的是饲粮中的水分活性Aw值,即饲粮中水分的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压比值。饲粮的Aw值越低,霉菌就越难的生长。在饲粮作物大米、小麦和豆类中Aw值在大于0.7时,大多数霉菌才能生长繁殖[53]

2.3霉菌毒素的危害

    动物霉菌毒素中毒症状会因饲粮中的霉菌毒素种类、剂量、饲喂动物的品种、时间、健康状况和霉菌毒素间的相互作用的影响而各不相同。 

2.3.1 黄曲霉毒素的危害

    (1) 抑制畜禽生长发育

AFT饲料饲喂动物后会干扰生物体的正常新陈代谢活动、导致生物体各项功能紊乱或障碍。畜禽类则会出现消化功能受损的现象,表现为食欲减退,体重增加变缓,贫血,营养缺乏和不良等。Lindemann[54]等试验用含不同剂量的黄曲霉毒素日粮饲喂小猪,发现猪的日增重随着日粮中黄曲霉毒素剂量的加下降趋势,肉料比降低。

    (2) 对免疫力的影响

由于AFT对生物体的免疫器官会造成损坏,使免疫器官功能受到抑制,饲养的动物中毒后机体的抵抗力会显著降低、易感疾病的概率增大,在AFT中毒后,如果使用药物对其治疗,疗效任然微乎其微[55,56]

    (3) 对生殖功能的影响

    AFT会对畜禽的生殖系统产生影响。母猪AFT中毒后不仅会引起产仔数减少、流产、产弱仔等情况,更为严重者还会死胎和木乃伊胎等现象;同时会导致母猪卵巢畸形、子宫扩张、肿胀及卵巢萎缩等症状,引起母猪子宫黏膜对雌性激素的感受性受到抑制、发情周期延长、繁殖力下降。对于公畜而言会使睾丸萎缩、雌性化现象发生。在家禽类动物母鸭则会引起雌性激素的分泌量减少、卵巢囊肿、产蛋率低等一系列症状。对于公鸡而言,饲喂饲料中含有一定量AFT会影响其生殖能力,使睾丸萎缩,曲精细管发育不良,妨碍精液生成。

    (4) 对代谢功能的影响

畜禽AFT中毒会对畜禽代谢系统构成影响,可以抑制生物体磷脂及胆固醇的合成,肝脏运输代谢脂类能力减弱,可引起生物体脂类水平升高,明显生物学特征是肝细胞内出现的脂肪浸润与脂肪沉积进而引起肝脏肥大,这是脂类在生物体内因AFT中毒造成的代谢受阻,溶解能力下降的结果所致。

    (5) 致癌与致畸作用

AFB1被公认为目前经口致癌力最强的天然物质,已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变作用[57]。陆东东[58]研究报道AFT中毒会导致P53基因突变与;生成的致癌物AFBOP53基因突变和肝癌的发生存在着紧密关联。

    (6) 对脏器的损害

AFT靶器官是肝脏它可引起所有动物以肝损伤为主要特征的症状。谷长勤[59]等通过试验研究发现,当雏鸭AFB1中毒时对机体造成的损伤波及到多个器官,其中以肝脏的损伤最为严重。

2.3.2 呕吐毒素的危害:

    DON主要污染饲粮类作物,对人和动物的健康构成潜在威胁。不同类型的动物对DON的敏感程度亦各不相同,其具有细胞、免疫和神经毒性以及“三致”作用,同时还对动物的消化系统构成影响。

    (1) 对消化系统的影响

DON进入动物消化道系统后会刺激消化道黏膜,使动物消化道出现炎症、出血、溃疡甚至坏死,导致动物食欲下降和废绝,在畜禽动物中猪的反应最为强烈。DON可以引起猪的呕吐、拒食、腹泻、食管穿孔以及营养不良等症状,还可使猪皮肤出现损伤或坏死[60,61]。有学者给育肥猪饲喂含DON 的饲粮,发现饲粮中的DON0.14 mg/kg的基础上每增加1mg/kg,肥育猪的采食量就相应减少6%,当饲粮中DON的含量超过10 mg/kg时,肥育猪即完全拒食,达到20 mg/kg肥育猪出现呕吐的现象[62]

    (2) 细胞毒性

DON对真核、原核、肿瘤和植物细胞也均有很强的毒性。DON主要作用于骨髓细胞、肠黏膜细胞、脾细胞以及胸腺细胞等分裂快的细胞。李群伟[63]等用DON对新西兰家兔做试验,发现DON对其膝关节软骨和滑膜造成了损伤,在不同剂量组中,低剂量使家兔膝关节软骨细胞变性、高剂量使家兔膝关节软骨细胞坏死。在对其组织和细胞的体外培养试验发现,DON有较强的细胞毒,被试细胞发生类似射线样的损伤,低剂量DON可抑制细胞的增殖,高计量的DON可使细胞形态明显改变,且都可引起细胞的凋亡[64]

    (3) 免疫毒性

DON既是一种免疫抑制剂,又免疫促进剂,在生物机体内可以双向调节免疫应答机制。既可以抑制对病原体的免疫应答,又可以诱发自身免疫反应,其效果与其剂量有关。DON影响生物体体内的免疫机能主要是经过诱导导致白细胞凋亡而实现的,同时在生物体体外DON也可导致TB等细胞的凋亡[65]Ghareeb [66]等研究报道DON可抑制肉鸡的蛋白质和脂质的新陈代谢,可使免疫细胞数量减少来减缓免疫反应。

    (4) 神经毒性

Prelusky[67]等报道,DON可以作用于动物脊髓液中的神经介质导致神经中毒。低剂量的DON对动物神经系统没有太大影响,而高剂量可显著引起动物因神经中毒而导致行为方面的异常变化。

    (5) “三致”作用

很多研究同时表明,DON还具有胚胎毒性和致畸作用。Vesely[68]等通过试验得出,用1~3 mg/kgDON作用于3日龄的鸡胚,可导致鸡胚发育畸形率显著上升。Lambent[69]等也发现,DON可导致大鼠发生上皮增生的症状。学者们根据对DON的研究,曾提出DON可能是人类某些恶性肿瘤和骨关节炎等疾病的病因,有些学者对此也做了相应的研究。

2.3.3 伏马菌素的危害

    (1) 马脑白质软化症 

    Kellerman[70]等用伏马菌素FB1对小马进行实验证明伏马菌素FB1可诱导马脑白质软化症。Marasas[71]等也用伏马菌素FB1对马进行实验,解剖发现脑部重度水肿延髓质坏死证明伏马菌素是诱发马脑白质软化症的主因。

    (2) 猪肺水肿综合症 

    伏马菌素可诱导的猪肺水肿,Smith[72]等研究伏马菌素对猪的危害发现,一定剂量的伏马菌素使猪出现全身动脉低血压动脉和混合静脉缺氧,代谢性酸中毒等病状。Kovcs[73]等用不同剂量的伏马菌素的毒害饲喂猪一段时间后出现了轻微或严重肺水肿而持续长时间喂食可导致猪也出现不可逆纤维化的肺。

    (3) 也有研究报道伏马菌素可诱发人类食道癌[74]、肝癌及胎儿神经管畸形[75]等疾病等。

2.3.4 赭曲霉毒素的危害 

    赭曲霉毒素对动物和人类的毒性因给药途径、实验动物的食物、年龄、性别的不同而不同,主要有肾脏毒性、肝毒性、致畸性、致突变、致癌性和免疫抑制作用。

(1) 肾毒性

    肾脏是OTA的主要靶器官。OTA中毒又可分为急性和慢性中毒两种现象。高剂量短期内便可出现急性中毒的现象,其可导致家禽血清的总蛋白、白蛋白、球蛋白、胆固醇等的降低,尿素、肌氨酸、磷酸酯酶和胆碱酯酶的升高。急性中毒之初表现为食欲减退、体重减轻、恶心、呕吐,随之便是直肠温度升高、结膜炎发脓、扁桃腺炎、口渴、多尿、脱水等现象严重者导致死亡。低剂量的慢性中毒对于家畜猪而言健康状况良好,但进食量会减少、出现体重增加缓慢,饮水和排尿增多等。最近几年,一些研究者认为在突尼斯地区不明原因的慢性间质性肾病,与该地区大量的食用品中含有OTA存在直接关联,被认为是OTA所导致的[76]

(2) 肝脏毒性

    用含有OTA毒素的饲料饲喂30d龄星波罗肉鸡3d后,星波罗肉鸡既出现精神萎靡,食欲减退,排绿便,消瘦等情况,持续饲喂在10-20d内便有死亡出现,对死亡肉鸡的肝脏进行观察发现肝细胞膜增厚,线粒体肿胀溶解,内质网减少,肝细胞溶解等现象,对各组织进行OTA毒素残留检测发现肝、肾、心肌等组织均有残留,其中以肝细胞和肾小球基底膜OTA残留量最高[77]

(3) 致畸致癌致突变性

    有很多报告称OTA有致细菌基因突变的能力[78]。最近通过研究怀孕小鼠的OTA试验,证明OTA可通过小鼠胎盘形成致畸致癌物,对一些器官造成损伤[79]

(4) 免疫毒性

    低计量的OTA就可对动物产生影响,影响最为显著的当数免疫系统,OTA充当免疫抑制剂角色,对动物的TB淋巴细胞介导的免疫反应进行抑制,导致免疫球蛋白IgGIg AIgM的下降[80]

2.3.5 玉米赤霉烯酮的危害: 

(1) 肝毒性

玉米赤霉稀酮主要在肝脏中进行代谢,对肝脏及肝细胞具有强烈的毒害作用。Conkova[81]等对家兔进行口服ZEN试验,检测血液发现中碱性憐酸酶、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶等水平显著升高,这显示肝脏有一定损坏。

(2) 致肿瘤性

有学者研究证实ZENMCF-7肿瘤的产生具有一定的促进作用,其具有刺激乳腺癌细胞生长的作用[82]Hassan[83]等也发现ZEN结合雌激素受体,导致动物机体生殖激素分泌紊乱,对繁殖机能造成严重影响,从而刺激人乳腺癌细胞生长[84]

(3) 生殖毒性

在家畜家禽动物中,猪对ZEN毒素是最为敏感。1992年,Kordic[85]等研究了在母猪饲料中添加22mg/kg体重的玉米赤霉稀酮,结果显示添加ZEN之后,母猪的生产性能和繁殖性能显著降低。此后,在2003年,有学者对大鼠进行单次腹腔注ZEN,饲养一段时间之后杀死大鼠,观察大鼠精子细胞以及大鼠精子细胞的组织病理学以及生长变化。结果表明,在注射ZEN后精子细胞、精母细胞都有受到损伤,推测这可能是导致精细胞数量下降以及睾丸萎缩的机制[86]

(4) 免疫毒性

Abid-Essefi[87]等报道,ZEN造成Vero以及Caco- 2细胞周期紊乱、抑制其蛋白质和DNA的合成,降低了VeroCaco-2细胞生存能力。此类报道可以看出,ZEN毒素对免疫器官造成威胁,降低机体免疫系统功能。

(5) 细胞毒性

    在2004年,Francesca[88]等研究发现ZEN对鳞翅类SF-9细胞有抑制生长毒性影响。2005年,Hassen[89]等研究报道,ZENHep G2细胞有显著的抑制作用,同年,Ouanes[90]等研究发现ZEN导致小鼠骨髓细胞染色体异常,同时,James[91]等研究显示,ZEN在体内还具有氧化性,引起脂质过氧化,抑制细胞内DNA的合成,从而造成细胞调亡。

2.4 霉菌毒素之间的相互作用:  

目前在我国饲粮中霉菌及其产生的多种毒素的污染率极高,同时2种或2种以上的霉菌毒素之间或存在互作效应,结果会导致饲粮中的毒性远远超过其中任何一霉菌毒素的毒力,出现1+111+1的情况,被称为毒素的加性或协同效应。常见的霉菌毒素加性效应有:OTADONDO NT-2毒素,FB1T-2毒素或DON, FB1DASOTA , FB1MON , OTA T-2毒素。实际生产生活中,饲粮中霉菌毒素种类远多于两种,但由于试验条件和水平的限制,多于两种以上霉菌毒素之间的联合效果见诸报道并不多见[92,93]

饲料及原料中的霉菌毒素和危害

霉菌毒素

原料及来源

毒   害

黄曲霉毒素

玉米、花生、棉花籽、小麦、大麦、燕麦、鱼粉

引起肝坏死,减少牛奶产量,导致胚胎死亡及抑制免疫系统

呕吐毒素

玉米、小麦、大麦、燕麦、米、麦芽

侵害畜禽消化道,使其采食量下降,拒食

玉米赤霉烯酮

玉米、小麦、大麦、高粱、鱼粉

雌激素亢进症,破坏动物繁殖能力

T-2毒素

玉米、小麦、大麦、米、鱼粉

产蛋率降低,神经失调,抑制免疫力

串珠镰刀菌素

玉米、米、其它谷物

脑白质液化性坏死

2.5 霉菌毒素去除方法

在实际生产活生中,饲粮及其原料被霉菌毒素污染是普遍的现象,也是丞待解决的难题。依靠当今的技术条件,对饲粮中的霉菌进行彻底控制并杜绝霉菌毒素的产生是不可能的。所以,饲粮中人们在不会导致霉菌毒素代谢产物的积累,不破坏或基本不影响饲料营养价值和不影响动物产品的质量的情况下对其灭活、破坏或去除霉菌毒素破坏霉菌孢子的方法进行脱毒和解毒处理。目前对饲粮中霉菌及其毒素的控制,一般从防霉和脱毒两个方面入手。 

2.5.1 防霉措施

1)控制饲料及原料含水量,保持储藏环境干燥。

    饲料原料从田间收获时水分含量偏高,若再逢下雨水以及晾晒不足等就储藏入仓或因饲粮存放时间过久,贮存环境潮湿,空气流通不畅就会造成霉菌生长繁殖。因此含水量较高的饲粮原料应及时晒干,储存仓库应通风、阴凉、干燥、地势高要定期检查、消毒、打扫、防鼠。储存饲粮时下面最好垫上支架,上方和周围要留足一定空间,便于通风。

2)缺氧防霉。

利用部分霉菌需氧才能生长繁殖和产毒的特性,人为制造缺氧环境以防霉去毒的效果。如黄曲霉、寄生曲霉等均为好氧霉菌,缺氧环境中生长会受到抑制。在多雨潮湿的季节,为防止湿玉米霉变,可将其脱粕后装入密封的塑料袋储藏,可以利用隔绝氧气的方法抑制黄曲霉菌等的生长产毒。

3)添加防霉剂。

在饲粮中添加一定计量的防霉剂是不失为防霉的一种重要措施。常用的防霉剂有:丙酸及其盐类、甲酸及甲酸钙等。在实际生产中常将适应范围与抗菌谱不同的防霉剂按比例配合,加入饲粮中以扩大适用范围增强防霉效果,尤其是高温高湿季节防霉效果最好。

2.5.2 脱毒措施

一般采用物理化学和生物的方法进行去除。

    (物理方法[94-97]

(1) 混合稀释法

是通过将霉变饲料与未霉变饲料进行简单混合,以降低饲料中毒素的浓度的一种方法[98],可以迅速有效的降低饲料中总霉菌毒素的含量。

    (2) 筛选法

    通过筛选去除霉菌污染物,减少其毒素污染,此法虽然简单易行但脱毒效果不彻底。通过人工或机械的方法将饲粮中霉变物剔除,或通过碾轧方式除去霉变物外皮而降低霉菌毒素的含量。霉菌污染的玉米或小麦通过人工或机械方法把未污染的选出来,饲粮中霉菌毒素的含量在一定程度上大大降低,但此法耗时费力代价太高。

(3) 色差分选法

    利用霉菌在饲粮原料上生长使其缺乏光泽的原理,将感染霉菌的粮食作物分选除去,此法简单易行具有较好的应用前景。

(4) 密度分离及洗涤技术

密度分离法是一种简单实用的分离方法。被霉菌及其毒素污染的饲粮密度会变低,在水中多会漂浮在上层,根据这种特点可以轻松将其分离,同时通过洗涤冲刷饲粮中的霉菌毒素会被带出一部分。上述两种方法的结合使用,可以使饲粮中霉菌毒素含量降低达到10%-40%

    (5) 热处理

    通过加热破坏霉菌毒素使其毒性降低的方法。但对大多数霉菌毒素的耐热性都很好。高温处理某些霉菌毒素如AFDONZEAOTA等对热都有高度稳定性,实际操作成本较高,并且可导致饲料中营养成分高温失活。据研究报道,AFT分解温度在237~306℃之间,AFBl267℃以下仍极其稳定[99]

    (6) 微波和紫外线处理

    用微波可以很好的将单端抱霉烯毒素破坏分解[100]紫外线和辐射也能破坏霉菌毒素,用高压汞灯照射发霉饲料,去毒率可高达97%99%[101]但这些方法需要占用较大的面积,难以批量实施,同时也会对营养成分有部分破坏[102],另有报道指出,紫外线照射可提高AF的毒性,甚至将之活化为致癌物[103]

    (7) 日光降解处理

    对粮食油脂中的AFT降解[104]效果较好。

    (8) 膨化加工处理

    对富马霉毒素的降解效果较好[105],有很好的应用前景。

    (9) 湿磨法[106]

    通过湿磨生产的淀粉中几乎不含玉米赤霉烯酮毒素、富马霉毒素和黄曲霉毒素,但是却增加T-2毒素的含量。

    (10) 吸附剂法

    当饲粮中霉菌毒素含量较高时,添加吸附剂进行脱毒是一种常用方法。霉菌毒素吸附剂主要有硅铝酸盐、活性炭、酵母细胞壁提取物等。其中硅铝酸盐类吸附剂多以膨润土或蒙脱石居多,它对极性强的AFT吸附效果较佳,但对极性弱的DONZEN等吸附效果较差[107]。此外,硅铝酸盐类吸附剂对霉菌毒素吸附的同时也会吸附饲粮中的营养物质;研究者们通过改良硅铝酸盐吸附剂使其达到对极性较弱的霉菌毒素吸附性升高,又对营养物质吸附力降低的效果[108]。葡甘露聚糖为酵母细胞壁分离出来的多糖,其对AFTDONZEN等毒素均有一定的吸附能力,且葡甘露聚糖还对动物还有积极的生理作用[109]。活性炭作为霉菌毒素吸附剂虽具较强的吸附力,但饲粮中的营养物质易与吸附位点结合,使其失去对霉菌毒素的吸附能力,实用效果不佳[110,111]。除了物理脱毒法外,对霉菌毒素污染的饲粮还可采用化学脱毒法和生物脱毒法等进行脱毒。

    (化学方法[112-116]

 (1) 碱处理水解

    可逆降解黄曲霉毒素及部分降解富马霉毒素,毒性仍然存在不是富马霉毒素及黄曲霉毒素的有效脱除方法。可减少脱氧瓜萎镰刀菌醇和玉米赤霉烯酮。

 (2) 酸性亚硫酸盐处理

    可破坏AFBl,减少脱氧瓜萎镰刀菌醇。酸性亚硫酸盐是一种常用的食品添加剂。

 (3) 氨化处理

    在墨西哥、南非及美国几个州都推行的粮食中黄曲霉毒素的脱除方法,对富马霉毒素的脱除可能无效。

 (4) 过氧化氢或重碳酸钠处理[117]

    可以有效降解富马霉毒素。

 (5) 臭氧处理

    粮食自然感染黄曲霉毒素的降解和脱除,应用前景较好。

    (生物降解法

传统的物理脱毒方法简单,成本低。但是该方法无法完全将受污染的谷物或者饲料分离开,不能从根本上解决问题,仅在部分霉菌毒素污染和少量轻微污染的情况下,发挥作用。化学脱毒方法法的主要缺点是各种化学物质只能对某种毒素有效而对其它毒素不能降解;另外,这些化学物质在饲料中的高残留问题无法有效而经济地去除,易对动物带来不利影响。特别是氨化作用对黄曲霉毒素的降解比较显著,同时可能因氨在饲料中的残留而影响动物的健康。生物降解法[118]主要有酶解法和微生物发酵法。酶解法主要是选用某些酶,利用其降解或破坏毒素从而达到脱毒的目的。因具有效率高、特异性强、对饲料和环境无二次污染,备受研究者们关注和研究。仅以黄曲霉毒素生物脱毒为例,早在20世纪70年代前后国外就有研究生物降解AFT的报道。1968Detroy[119]首先报道真菌树状指孢霉(Dactylium dendroide)可以降解AFBl,揭开了生物降解AFT研究的序幕,其后人们分别研究了少根根霉、寄生曲霉、曲霉、绿色木霉、毛霉菌、茎点霉、糙皮侧耳、白腐菌等真菌对AFB1的降解效果。国内在在这方面的研究起步在二十世纪末,较国外晚。刘大岭[120]及其研究小组在国内率先于1995年开展了这方面的研究工作,且取得显著成果。近几年徐海军[121]等从猪粪中筛选到芽孢杆菌ODS-1菌株不仅对黄曲霉毒素B1的有较高的降解率,同时对呕吐毒素、玉米赤霉烯酮也有较高的降解率,这为后来开发霉菌毒素降解菌剂奠定了基础。2012年赵丽红[122]等经过前期大量的筛菌工作,从532株菌中筛选出一株能够高效降解AFB1霉菌毒素的枯草芽孢菌株以后又逐步筛选出能够高效降解玉米赤霉烯酮、呕吐毒素等多种霉菌毒素的菌株,经北京科润生科技发展有限公司成功转化,生产的霉菌毒素生物降解剂商品名为百霉解”BMJ),通过对饲喂含AFB1霉变玉米日粮蛋鸡和猪得到验证效果。

3 研究内容及技术路线

3.1 研究内容

本试验所用霉菌毒素生物降解剂制剂由由北京科润生科技发展有限公司提供,商品名百霉解(BMJ,主要成分为霉菌毒素解毒免疫增强剂枯草芽孢杆菌氧化自由基清除因子

在含有发霉花生粕(经测定含有霉菌毒素)黄河鲤鱼饲料中,分别添加不同量霉菌毒素生物降解剂研究其对黄河鲤鱼生产性能、生化等指标的影响

 

3.2 技术路线

 

 

 

 

 

 

 

 

 

章 霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼饲用效果的影响

国内外用生物学方法降解饲料中黄曲霉毒素的应用非常少,至今为止,还没有关于饲料黄曲霉毒素解毒酶添加在鲤鱼饲料中的相关报道。本试验选择黄河鲤鱼为研究对象,通过饲喂含黄曲霉毒素的饲料,并添加不同比例的霉菌毒素生物降解剂,研究对鲤鱼生长性能和生理生化指标的影响应用新型解毒酶提供理论依据。

1材料与方法

1.1 试验材料及试验动物

霉菌毒素生物降解剂又称百霉解(BMJ,由北京科润生科技发展有限公司提供。试验用黄河鲤鱼由河南水产研究院提供。

 

1.2 试验设计

选择39.5±0.8g左右黄河鲤750尾,随机分成5个处理,分别为正对照组、负对照组(AFB1组)和试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组。每个处理设5个重复,每个重复30尾鱼。正对照组饲喂基础日粮,基础日粮的花生粕中不含AFB1,负对照组为基础日粮+AFB1的花生粕(AFB150μg/kg),试验组日粮每吨中分别添加0.25 kg0.50 kg1.00 kg的黄曲霉毒素解毒剂。试验期 60 d

1.3 试验日粮

配制基础日粮前,测定霉变花生粕中AFB1含量为350 ppb(其它霉菌毒素未测),根据相关文献,负对照组和试验组中AFB1含量确定为50 ppb。基础日粮参照NRC1994)鲤鱼营养需求标准的基础上进行配制,其中蛋白源采用花生粕作为唯一蛋白源,营养水平和组成(见表2-1)。基础日粮的花生粕中不含AFB1,负对照组和试验组配方为,把基础日粮中花生粕中的14%用等量发霉花生粕代替。试验分组、日粮中霉菌毒素生物降解剂添加量和实测AFB1含量(见表2-2)。

表2-1 基础日粮组成及营养水平(风干基础)

项目

饲料组成(%)

基础日粮

基础日粮+50μg/kgAFB1

花生粕

63

49

发霉花生粕

0

14

麸皮

11

11

次粉

16

16

豆油

8

8

预混料

2

2

合计

100

100

粗蛋白

29.36

29.34

粗脂肪

9.71

9.71

粗灰分

6.8

6.8

总能(MJ/kg)

22.6

23.1

注:预混料每千克日粮中的复合维生素和无机盐包括:维生素A,0.50 mg;维生素B1,3.50 mg;维生素B2,10.00 mg;维生素B6,6.50 mg;维生素D3,0.06 mg;维生素E,4.50 mg;维生素K3, 8.00 mg;硫胺素,3.00mg;硫胺素,2.00 mg;泛酸,6.00 mg;生物素,0.20 mg;;硫酸亚铁,109.58 mg;硫酸铜,8.14 mg;硫酸锌,78.04 mg;硫酸锰,105.00 mg;碘化钾,0.34 mg;氯化胆碱,1,500 mg.

 

表2-2试验分组和日粮中霉菌毒素生物降解剂添加量和实测AFB1含量

处理组

日粮中霉菌毒素生物降解剂添加量

实测AFB1含量

对照组

基础日粮+0kg/T霉菌毒素生物降解剂

5.4μg/kgAFB1

AFB1

基础日粮+50μg/kgAFB1+0kg/T生物降解剂

51.7μg/kgAFB1

试验Ⅰ组

基础日粮饲料+50μg/kgAFB1+0.25kg/T生物降解剂

50.8μg/kgAFB1

试验Ⅱ组

基础日粮饲料+50μg/kgAFB1+0.50kg/T生物降解剂

51.2μg/kgAFB1

试验Ⅲ组

基础日粮饲料+50μg/kgAFB1+1.00kg/T生物降解剂

50.6μg/kgAFB1

1.4 饲养管理

饲养在直径50 cm,高55 cm的塑料桶内,其中24h连续充氧,水温控制在25±1。每天定时上午8:00、中午12:00和下午6:00三次定时定量投喂饲料,每天喂量以鱼重5的为准,每星期对每组鲤鱼随机捞取5尾称重,为下星期调整饲喂量提供依据。每天记录各处理组残饵量和消耗量,每天观察鱼的健康状况并记录水温、投饲量和鱼死亡情况。每周取水样用于测定养殖水体的水质指标,每次取完水样后换水1 /2

1.5 样品采集和检测

1.5.1 生长性能指标

在试验开始、第10203040和第50天以个体为单位对所有试验黄河鲤鱼进行称重,测量数据前一天停止饲喂,以便第二天测量数据以计算末体重、体重增长率、成活率、体长增长率、饵料系数、肝体比和脾脏指数,其中肝体比于试验第30天和第60天测定,脾脏指数于第45天测定。

计算公式如下:

末体重=鲤鱼末重-鲤鱼初始体重

成活率(%)=(试验末存活数/试验初总数量)×100%

体重增长率(%)=[(试验末平均体重-试验初平均体重)/试验初平均体重]×100%

体长增长率(%)=[(试验末平均体长-试验初平均体长)/试验初平均体长]×100%

饵料系数=摄食量/(平均末重-均初始体重)

肝体比=(肝脏重/鲤鱼个体重)×100

脾脏指数=(肝脏重/鲤鱼个体重)×100

1.5.2 血清抗氧化指标测定

在试验的第44天时停止喂食一天,于第45天,每个处理组的每桶鲤鱼中随机取3尾麻醉后,采取尾部静脉法采血,血样先收集在离心管中,室温下在4.0X103r/min条件下离心10min离心完毕后,同一处理组血清样集中收集,保存于4℃待用。以测定血清中总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)含量,均按试剂盒说明进行,检测试剂盒均从南京建成生物工程研究所购买。

计算公式如下:

公式一:

    公式二:

公式三:

1.5.3 血清免疫指标测定

于试验第45天,采取尾部静脉法采血,血清的收集同测定血清抗氧化指标相同,以测定血清中溶菌酶(LSZ)和碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒均从南京建成生物工程研究所购买,均按试剂盒说明进行。

计算公式:

公式四:

     公式五:

1.5.4 肝脏和肠道酶活指标测定

在试验的第44天时停止饲喂一天后,于第45天每一水簇箱取3尾黄河鲤鱼为一混合样,用滤纸吸干水分后称重置无菌操作台上解剖取出全部肝胰脏和消化道剔除脂肪和消化道内容物分别取肝胰脏和肠样,加入10倍的PBS溶液用玻璃匀浆器在冰浴中手工匀浆。而后在4℃、10000r/min离心15min, 获得的上清液即为粗酶液并置于4℃冰箱中待用。蛋白酶、脂肪酶(LPS)和淀粉酶(AMS)的测定采用从南京建成生物工程研究所购买的试剂盒进行。

计算公式:

公式六:

    公式七:

    公式八:

1.5.5 消化道微生物指标测定

在试验第44d养殖后停食24h,于第45天从每个重复的每桶中随机抽取3尾鱼为一混合样,从中取4尾,用0.5 g/LMS-222将鱼麻醉后,在无菌操作台上进行解剖,取出消化道和肝胰脏,用蒸馏水清洗外表面。将消化道的前端扎结,取0.5g左右肠道内容物储藏无菌离心管中,在4℃下保存,在24 h内用于分析微生物菌群数量。在无菌条件下,将储藏无菌离心管中肠道内容物取0.1g放入2.0mL离心管中,加入0. 85%的生理盐水0.9 mL,充分混匀,制成10倍稀释液;再取0.1mL10倍稀释液的加0. 9 mL生理盐水充制成102倍稀释液。同时依次制成103104105106倍稀释液。其中肠道内容物中的细菌总数、大肠杆菌、乳酸菌、芽孢杆菌、气单胞菌、弧菌、假单胞菌的培养,分别选择胰蛋白胨大豆琼脂TSA、伊红美蓝琼脂EMB、乳酸菌培养基MRS、甘露糖蛋卵黄多粘菌素琼脂MYP和弧菌选择性培养基TCBS在有氧、30℃分别培养24 h18 h24 h24 h24 h24 h。肠道内容物分别取1031041053个稀释梯度的100μL稀释液以平板涂布法接种于相对应的选择性培养基上,然后进行菌落计数。重复测定3次。计算每克肠道内容物的菌数,结果以对数值 ( lg CFU /g) 表示。

1.5.6 肝脏和性腺中AFB1残留指标测定

采血后的鲤鱼取出肝胰脏组织和性腺组织,称取组织标样1.0mg左右重量,加入1000ulPBS缓冲液,超声破碎仪将标本匀浆,2.5X103r/min离心15分钟,收集上清进行检测。将取过肝胰脏和性腺的每尾鲤鱼解剖取背部白肌每尾5ɡ置于搅拌机混合搅拌均匀,取样0.5mg,后续处理和肝胰脏和性腺相同。实验用试剂盒从上海邦奕生物科技有限公司购买,实验步骤和操作均按试剂盒说明书进行。

计算公式:

公式九:

一、百分吸光率的计算,标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0 ppb)的吸光度值,再乘以100%,即:

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B00(ppb)标准溶液的平均吸光度值

二、标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标,以黄曲霉毒素B1标准品浓度(ppb)的对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1实际量。

1.6 数据统计与分析

数据采用SPSS13.0软件进行单因子方差分析,差异显著者进行Duncans多重比较。试验结果用平均值±标准差表示mean±S.D.,显著水平为P <0.05

结果与分析

2.1 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肝脏形态颜色和肝体比的影响

由表2-3可以看出AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肝脏形态与颜色的影响,在第30天时对照组和试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的黄河鲤鱼肝脏在外观形态和颜色上,差别不大。但AFB1组与其他试验组相比肝脏的颜色截然不同为黑褐色,且肝脏形态稍小。在第60天时对照组、试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的黄河鲤鱼肝脏在外观形态和颜色上与在第30天时观察的相似;其中AFB1组肝脏的颜色依旧为黑褐色,但是肝脏形态明显增大。肝体比方面,在第30天时AFB1组与其它组相比差异显著且为最小,在第60天时AFB1组与其它组相比差异仍然显著但为最大(P0.05)

 

表2-3 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼形态和颜色的影响

项目

检测

时间

对照组

AFB1

试验Ⅰ组

试验Ⅱ组

试验Ⅲ组

肝脏大小

30

正常

稍小

正常

正常

正常

60

正常

较大

正常

正常

正常

肝脏形状

30

无固定形状

无固定形状

无固定形状

无固定形状

无固定形状

60

无固定形状

无固定形状

无固定形状

无固定形状

无固定形状

肝脏颜色

30

淡红色、米黄色

暗黑色

淡红色

淡红色

淡红色

60

淡红色、米黄色

暗黑色

淡红色

淡红色

淡红色

肝脏分布

30

弥散分布

弥散分布

弥散分布

弥散分布

弥散分布

60

弥散分布

弥散分布

弥散分布

弥散分布

弥散分布

肝体比

30

2.56±0.03b

2.20±0.10a

2.54±0.09b

2.64±0.05c

2.59±0.04bc

60

2.55±0.06b

3.24±0.10

2.55±0.11b

2.58±0.10bc

2.57±0.02b

2.2 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼生长指标的影响

由表2-4 可以看出AFB1严重影响黄河鲤鱼的生长性能。在试验第30天,AFB1组与对照组相比,终末体重降低9.9%P0.05),饵料系数升高 63.8%;在试验第60天,AFB1组与对照组相比,终末体重降低23.0%P0.05),饵料系数升高 77.6%。试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组无论在第30还是第60天,终末体都逐渐升高,饵料系数都逐渐降低,其中试验Ⅲ组基本消除了AFB1对黄河鲤鱼终末体重和饵料系数方面的不良影响,在试验第30天,终末体重较对照组相比相差2.2%,饵料系数相差1.6%,在试验第60天,终末体重较对照组相比相差0.3%,饵料系数相差0.8%,且都差异不显著(P0.05)。总体而言试验各组黄河鲤鱼在终末体重和饵料系数方面在两个检测时间点上AFB1组与对照组相比都差异显著(P0.05)试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组各项生长指标较AFB1组均有所恢复,在试验Ⅲ组中基本达到对照组的正常水平。

 

表2-4 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼生长指标的影响

项目

检测时间

对照组

AFB1

试验Ⅰ组

试验Ⅱ组

试验Ⅲ组

初体重(g)

1

39.52±0.8a

39.20±0.7a

40.24±1.2a

39.17±0.7a

39.75±1.1a

末体重(g)

30

62.57±0.80b

56.36±0.93a

61.73±1.85b

62.55±1.50b

63.97±1.82b

60

92.79±1.71d

71.35±0.84a

75.64±1.70b

82.57±1.43c

93.11±1.22d

饵料系数

30

2.57

4.21

2.67

2.60

2.53

60

2.54

4.51

2.73

2.60

2.56

:同行数据肩注字母不同者表示差异显著(P<0.05),未标注或字母相同表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.3 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼存活率的影响

  

2-1 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼存活率的影响

从图2-1可以看出情况。在试验刚开始的第10天时试验各组黄河鲤鱼的存活率就存在明显差别,其中AFB1组的存活率较低,对照组的存活率最高,试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组较为接近处于中间水平;有图片同时可以看出在开始到第40天时间黄河鲤鱼的存率存在变化,但到40天以后基本趋于水平不在变化。

2.4  AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼血清抗氧化指标的影响

表2-5 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼血清抗氧化指标的影响

项目

对照组

AFB1

试验Ⅰ组

试验Ⅱ组

试验Ⅲ组

总抗氧化能力T-AOC(U/mL)

6.45±0.43d

4.34±0.33a

5.58±0.52b

5.62±0.79b

6.04±0.35c

总超氧化物歧化酶T-SOD(U/mL)

63.23±5.38d

55.48±3.06a

58.83±2.56b

60.23±5.82c

65.49±4.36e

丙二醛

MDA(nmol/mL)

7.65±0.27a

15.98±0.76c

11.08±0.95b

7.68±0.28a

7.65±0.39a

由表2-5可以看出AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼血清抗氧化指标的影响。黄河鲤鱼血清抗氧化指标中总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶的趋势比较接近,其中对照组与AFB1组相比差异最显著(P0.05)分别降低32.7%12.3%,在试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组中逐渐升高,试验Ⅲ组中虽与对照组差异显著(P0.05),但在各组中为最接近的水平,试验Ⅲ组中总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶与对照组相比分别相差6.4%3.6%。黄河鲤鱼血清丙二醛中与总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶的趋势正相反,其中AFB1组与其他各组相比差异显著(P0.05)且为最高,在试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组逐渐降低,且在试验Ⅱ组就达到与对照组差异不显著的水平(P0.05)AFB1组和对照组相比升高108.9%,试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和对照组各组间相互差异不显著(P0.05)

2.5 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对免疫指标的影响

表2-6 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼免疫指标的影响

项目

对照组

AFB1

试验Ⅰ组

试验Ⅱ组

试验Ⅲ组

脾脏指数

(%)

0.18±0.02c

0.15±0.01a

0.17±0.03b

0.18±0.01c

0.21±0.03d

溶菌酶LSZ

(U/mL)

401.58±11.23d

325.04±8.79a

344.75±9.86b

384.62±14.38c

395.08±12.11d

碱性磷酸酶

ALP(U/L)

38.35±1.48d

27.55±0.87a

31.24±1.27b

35.68±2.08c

39.16±1.13d

由表2-6可以看出AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼免疫指标的影响。AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼免疫指标:脾脏指数、溶菌酶和碱性磷酸酶的影响表现出较高的相似性,仅在个别组间存在细微差别。三项中都在AFB1组中值最低且与其它各处理组间差异显著(P0.05)。随试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组中霉菌毒素生物降解剂剂量的增加,三项免疫指标逐步上升,在溶菌酶中试验Ⅲ组达到与对照组差异不显著,在脾脏指数和碱性磷酸酶中试验Ⅱ组已达到与对照组差异不显著的水平(P0.05)

2.6 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肠道和肝胰脏消化酶活性的影响  

项目

部位

对照组

AFB1

试验Ⅰ组

试验Ⅱ组

试验Ⅲ组

蛋白酶活性

肠道

65.59±0.86e

48.93±0.90a

53.28±1.07b

58.35±1.48c

63.47±0.82d

肝胰脏

5.46±0.20c

2.11±0.04a

2.10±0.02a

4.76±0.55b

5.39±0.75c

淀粉酶活性

肠道

35.40±2.37c

32.73±1.45a

34.41±1.57b

34.29±2.07b

35.74±2.85c

肝胰脏

28.43±1.42c

24.69±0.63a

26.69±2.02b

28.11±1.37c

28.53±1.86c

脂肪酶活性

肠道

62.18±2.64b

51.48±3.20a

51.10±5.02a

62.05±3.31b

62.17±2.67b

肝胰脏

106.09±4.06d

85.36±4.57a

92.37±3.61b

97.26±5.18c

112.47±4.85e

表2-7 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肠道和肝胰脏消化酶活性的影响

由表2-7可以看出AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肠道和肝胰脏消化酶活性的影响,无论肠道和肝胰脏中的蛋白酶活性、淀粉酶活性和脂肪酶活性都在AFB1组较低,除肝胰脏中的蛋白酶活性和脂肪酶活性AFB1组与试验Ⅰ组差异不显著外(P0.05),其余各实验组都与AFB1组差异显著(P0.05)。随试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组中霉菌毒素生物降解剂剂量的增加,肠道和肝胰脏中的蛋白酶活性、淀粉酶活性和脂肪酶活性值都随之上升;其中肝胰脏中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的试验Ⅲ组与相应的对照组达到差异不显著水平(P0.05);肠道中淀粉酶的试验Ⅲ组与相应的对照组达到差异不显著水平(P0.05),肠道中蛋白酶、和脂肪酶的试验Ⅲ组虽与相应的对照组差异显著(P0.05),但却是各组中与对照组最接近的。总体而言试验各组的试验Ⅲ组达到或接近对照组的程度。

2.7 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼消化道微生物菌群的影响

表2-8 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼消化道微生物菌群的影响          CFU/g

项目

对照组

AFB1

试验Ⅰ组

试验Ⅱ组

试验Ⅲ组

总需氧菌

7.29±0.16

7.27±0.07

7.26±0.34

7.32±0.21

7.30±0.52

大肠杆菌

7.11±0.64a

11.86±1.22d

8.10±0.62c

7.35±0.77b

7.21±0.87ab

乳酸杆菌

6.84±0.82c

5.08±0.75a

5.26±0.71b

6.81±0.57c

6.85±0.23c

芽孢杆菌

3.43±0.32c

1.49±0.44a

2.60±0.43b

3.33±0.17c

3.58±0.85c

致病性弧菌

6.59±0.26a

8.37±0.57d

6.80±0.87b

6.43±0.54a

6.39±0.26a

由表2-8可以看出AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼消化道微生物菌群的影响,其中AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼消化道总需氧菌的影响不大,各组间差异不显著(P0.05);大肠杆菌和致病性弧菌都在AFB1组值最大且与其它各实验组差异显著(P0.05),随试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组中霉菌毒素生物降解剂剂量的增加,消化道中大肠杆菌和致病性弧菌开始降低,两项的试验Ⅲ组均达到与空白组差异不显著的水平,且在致病性弧菌项中在试验Ⅱ组已达到与空白组差异不显著的水平(P0.05)。消化道中乳酸杆菌和芽孢杆菌与大肠杆菌和致病性弧菌的趋势正相反在AFB1组值最低,与其它各实验组差异显著(P0.05),随饲料中霉菌毒素生物降解剂剂量的增加而升高都在试验Ⅱ组已与空白组差异和试验Ⅲ组间差异不显著(P0.05)。同时还体现出,添加芽孢杆菌剂量低时效果不显著,当达到一定剂量后效果较好。

2.8 霉菌毒素生物降解剂霉菌毒素生物降解剂对黄河肝脏和性腺中AFB1的影响 

    表2-9肝脏和性腺中AFB1积累量(μg/Kg)和霉菌毒素生物降解剂添加量(kg/T)之间的关系

组别(Groups

肝脏中AFB1含量(μg/kg)

性腺AFB1含量(μg/Kg)

对照组

2.13±0.25a

  2.01±0.38a

AFB1

4.48±0.37d

  2.71±0.15c

试验Ⅰ组

2.72±0.14c

  2.18±0.17b

试验Ⅱ组

2.54±0.62b

  2.07±0.11a

试验Ⅲ组

2.48±0.19b

  2.05±0.18a

 

表2-10 AFB1残留量(μg/Kg)和饲料中霉菌毒素生物降解剂添加量(Kg/T)关系

项目

回归方程

回归系数

极值点XKg/t

肝脏中AFB1残留量

y = 4.5673x2 - 6.4058x + 4.3589

R² = 0.9346

0.70

性腺中AFB1残留量

y = 1.4327x2 - 2.0542x + 2.6811

R² = 0.9646

0.72

试验第45天时对黄河鲤鱼肝胰脏和性腺中AFB1累积量进行测定,如表2-9。肝胰脏和性腺中AFB1累积量保持了高度的一致,均在AFB1组累积量最高且与其它各处理组间差异显著(P0.05),均在在试验Ⅱ组已与空白组差异和试验Ⅲ组间差异不显著(P0.05);整体趋势随饲料中霉菌毒素生物降解剂添加量的增加AFB1累积量而降低且呈二次曲线关系,回归方程如表2-10,可以清楚的得出试验Ⅲ组中霉菌毒素生物降解剂的剂量足够减轻或缓解了AFB1在黄河鲤鱼肝脏和性腺中的累积。根据回归公式按照肝脏和性腺中残留量最低进行估算,日粮中AFB150ppb条件下霉菌毒素生物降解剂(BMJ)的最适添加量为0.700.72kg/t

3 讨论

3.1 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肝脏形态与颜色的影响   

黄河鲤鱼,属鲤形目、鲤科、鲤亚科、鲤属,为杂食性淡水大型养殖鱼类。肝脏是动物体最大的代谢功能器官,并具有去氧化、解毒、贮存肝糖元及维生素 A、合成血浆蛋白等重要生理功能;胰脏是主要的分泌器官,是动物体重要的器官之一。鲤鱼肝胰脏体积甚大且较为疏松、狭长,附着于肠部,呈分散的不定形结构。位于整个腹腔内肠道周围。鲜解剖时腺体呈淡红色,此后组织渐呈米白色。黄曲霉毒素的靶器官为肝脏,会对肝脏产生损伤和病变,在此通过感官指标发现黄河鲤鱼饲喂AFB1后肝脏的颜色变为黑褐色,在前期形态稍小,后期增大。李梦云[123]等认为但中毒早期对肝脏的损害只是肝萎缩而不是肝增大。随着时间的延长由于脂肪在肝脏沉积才出现明显肝增大。本试验结果与之相似,在试验第30天时肉眼观察到AFB1组肝脏形态在各组中稍小,计算得出肝体比亦是各组中最小,在试验第60天时AFB1组肝脏形态在各组中较大,计算得出肝体比亦是各组中最大。孔青[124]等报道在虹鳟鱼在AFB1的慢性中毒中会有白鳃、水肿、黄眼睛、黄色的黏膜或皮肤和肝损伤等现象。正常鲤鱼肝脏为淡红色一段时间后变为米白色,但在本试验中发现AFB1组的黄河鲤鱼肝脏为黑褐色,产生这种现象的原因应该与AFB1导致肝脏坏死有关。

3.2 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼生长指标的影响 

AFB1中毒分为:高剂量时急性死亡和低剂量时的慢性蓄积性中毒[125,126];在实际养殖条件下AFB1中毒主要表现为慢性中毒[127,128,129]。如表2-3所示,在试验结束时含AFB1组在终末体重和饵料系数与其他组相比显著差异(P<0.05)。这与Deng[130]报道的用不同梯度水平的AFB1饲料饲喂罗非鱼,罗非鱼的摄食率随饲料中AFB1含量的增加而降低的结果相似。当饲料中添加霉菌毒素生物降解剂,黄河鲤鱼的终末体重、饵料系数升高到与空白对照组间的差异已不显著(P>0.05)。这说明AFB1通过破坏或抑制了黄河鲤鱼机体的代谢系统从而降低了生长性能。同时霉菌毒素生物降解剂组生长性能指标均恢复到正常水平,与对照组无显著差异,饲料中霉菌毒素生物降解剂可以在肠道中降解大部分AFB1,从而解除了AFB1对机体代谢和生长性能的不利影响。

3.3 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼存活率的影响 

当摄入低至中等剂量黄曲霉毒素并经过一段较长时间后,将产生慢性的黄曲霉毒素中毒,通常由于慢性和临床症状不明显而很难识别或诊断,其主要的临床症状与肝功能逐渐受损相关,如饲料效率降低、体重下降、增加对传染性继发症的易感性、肝和其它器官坏死和生长肿瘤、死亡率增加[131]。本试验中AFB1组的存活率较低,随试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组饲料中霉菌毒素生物降解剂剂量的增加存活率升高,其中对照组的存活率最高,这说明在含AFB1 50 ppb的饲料会导致黄河鲤鱼存活率降低,霉菌毒素生物降解剂能够很好的缓解AFB1对黄河鲤鱼的毒害,降低了死亡率;同时在40天以后所有试验组都趋于稳定,这可能与黄河鲤鱼机体产生耐受性有关。

3.4 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼血清抗氧化指标的影响 

需氧生物体的抗氧化能力在一定程度上反映了其健康的状况。总抗氧化水平常用来衡量生物体机体抗氧化性能的综合指标,其大小首先可反映生物体对外部作用的代偿水平和机体对自由基代谢的能力[132],其次也可作为抑制生物体脂质过氧化产物能力的评估指标[133]。超氧化物歧化酶是机体清除体内超氧阴离子自由基的酶类,能够催化超氧阴离子发生歧化反应,生成H2O2O2CAT则将H2O2分解成H2OO2,从而清除超氧阴离子自由基,起到保护细胞免受损伤的作用[134]MDA 是体内氧自由基的终产物,可以反映细胞受损伤程度以及脂质过氧化程度[135]。因此,血清中SODMDA呈对立与统一的关系,两者一般在血液指标测定时起到相辅相成的作用[136]。本试验研究发现,饲喂 AFB1饲料后黄河鲤鱼血清的抗氧化能力T-AOCT-SOD都下降,而脂质过氧化产物MDA的含量升高,且与其它处理组差异显著显著差异(P<0.05); 当饲喂添加霉菌毒素生物降解剂的饲料后,血液中的抗氧化能力恢复或接近对照组的水平。 这与侯然然等[137]报道,在肉仔鸡饲粮中添加一定量的AFB1导致其抗氧化酶活性显著降低和MDA的含量显著升高的结论不谋而合,与沈文英等[138]在试验组草鱼饲料中添加 1×105 cfu /g 的芽孢杆菌,其血清T-AOC以及T-SOD活性均较对照组高,MDA 含量较对照组低的结论吻合。这大概是芽孢杆菌微生态制剂通过自身分泌抗氧化酶或作为抗氧化酶激活剂,促进机体抗氧化酶形成,高效清除了机体自由基有关。 

3.5 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼免疫指标的影响 

水生动物中黄曲霉毒素中毒存在免疫反应受到抑制[139],脾脏是鱼类主要的免疫器官之一,其重量变化在一定程度上反映着机体免疫功能的变化[140]。研究已表明,LSZ是一种能水解细菌细胞壁中黏多糖的碱性蛋白,其主要作用于革兰氏阳性菌,是机体吞噬细胞杀灭病原菌的物质基础[141]。有学者认为,鱼类的LSZ活性比高等脊椎动物的更强,起到重要的防御功效[142]AFB1进入生物机体后会抑制呼吸链中的电子传递,造成氧化磷酸化就受到抑制,导致肝脏细胞受损细胞膜通透性增加,ALP主要存在于肝细胞胞浆内其损伤时被释放到血液中,使血清中ALP 活性明显升高[143]ALP 是生物体机体内巨噬细胞溶酶体的标志酶,具有转移和代谢磷酸基团的作用[144],它可通过水解、修饰或改变等作用[145],提高机体免疫力。霉菌毒素生物降解剂对血清 ALP 活性的增强作用与陆家昌等[146]、刘晓勇等[147]对杂交鲟的研究结果一致,说明霉菌毒素生物降解剂可增强机体的免疫力。这说明饲料中添加霉菌毒素生物降解剂可以提高鲤鱼的免疫功能,这可能是通过改善水生动物自身分泌免疫激活剂来实现的。

3.6 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肠道消化酶活力的影响 

AFB1中毒,通常会导致饲料效率降低,主要原因与鱼类的消化酶活力具有直接关系。淀粉酶在鱼类的消化器官中普遍存在,但因鱼的种类和消化器官各不相同古淀粉酶的活性千差万别。总体而言,鱼类淀粉酶的活力较低。脂肪酶是能够切断酯键的酯酶,能够水解甘油酯、磷脂和蜡酯。脂肪在脂肪酶的作用下,分解而被鱼体消化吸收利用,在鱼类消化系统胰脏是分泌脂肪酶的主要器官[148]。本研究结果表明,鲤鱼肝胰脏脂肪酶活力远高于肠道,这主要和胰脏是脂肪酶主要分泌器官有关。很多研究结果证实,益生菌可以增强鱼类蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力[149],有促进营养物质降解和消化吸收,进而促进鱼类生长的作用。Rodulf[150]Zhao[151]研究报道,影响草鱼的淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活力因素较多,甚至饲料组成也能够对其构成影响。本试验中霉菌毒素生物降解剂能增加了鲤鱼机体消化酶活性的主要原因应在于霉菌毒素生物降解剂在肠道内能分泌多种酶类进入宿主肠道中提高了宿主肠道消化酶活力有关[152]

3.7 霉菌毒素生物降解剂和AFB1对黄河鲤鱼肠道菌群的影响 

肠道菌群对鱼虾类的生长、生存至关重要[153]。关于AFB1能够影响水生生物体肠道菌群的报道很少见诸报到。本试验中总需氧菌受AFB1的影响不大,大肠杆菌和致病性弧菌都在AFB1组值最大,乳酸杆菌和芽孢杆菌在AFB1组值最小,存在显著差异(P0.05)。关于芽孢杆菌作为饲料添加剂对鱼类和其它水生动物的促生长作用已有大量报道[154],陈勇等[155]研究报道,饲料中添加益生菌可减少鲤肠道大肠杆菌的数量,许禔森[156]研究也报道草鱼饲料中添加益生菌其肠道中有害弧菌数量会降低,刘波等[157]也报道,地衣芽孢杆菌可使异育银鲫肠道内有益菌芽孢杆菌和乳酸杆菌数量大大增加,有害菌大肠杆菌数量明显降低本试验结果表明,饲料中添加霉菌毒素生物降解剂可以明显增加鲤鱼肠道芽孢杆菌数量,同时减少大肠杆菌和弧菌数量,这一结果与众多研究结果一致众多报道证实,饲用芽孢杆菌不仅能促进生物体肠道有益菌群增加,且能能产生蛋白类拮抗物质,拮抗肠道病原细菌[158],形成优势菌群,该优势菌群能够抑制或杀灭有害菌,从而起到调整肠道微生态环境平衡作用。

3.8 AFB1和霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼肝脏和性腺中AFB1积累量的影响

饲料AFB1污染尤其是AFB1污染进入鱼体内后代谢物会残留在鱼体组织中,不仅会导致鱼类死亡造成经济损失而且会通过食物链对更多的物种和人类的健康和生命安全构成威胁。FDA[159]规定食品和饲料中AFB1的安全限量分别为 5μg/kg 20μg/kg,在体内AFB1主要通过肝脏代谢,同时会导致肝脏受到严重损坏。本试验结果表明,饲料中的AFB1被黄河鲤鱼摄入后,在肝脏、性腺中均有一定程度的残留。 AFB1在黄河鲤鱼肝胰脏和性腺中的累积程度趋势相似且与霉菌毒素生物降解剂添加之间有显著影响。在试验各处理组中黄河鲤鱼肝胰脏组织中AFB1的积累量较高,此结果与Deng[160]报道的在饲喂罗非鱼含一定剂量AFB1饲料一定时间后,其肝脏中AFB1的积累高达24μg/kg的积累量结论较为相近。当饲喂添加在一定剂量的霉菌毒素生物降解剂后,黄河鲤鱼肝脏组织中AFB1积累量显著降低。黄河鲤鱼肝脏和性腺中AFB1积累量和基础日粮中霉菌毒素生物降解剂添加量之间存在的关系如表2-6。肝脏和性腺中AFB1积累量随着饲粮中霉菌毒素生物降解剂添加量的增加而降低(P<0.05),且都呈负对数关系如图2-1,得出回归方程如表2-7。在日粮中添加不同剂量的霉菌毒素生物降解剂,能够显著降低黄河鲤鱼肝脏、性腺中AFB1的含量其中霉菌毒素生物降解剂添加量为1Kg/T时效果最好。这与刘大岭等[161]研究报道的,一定范围内,AFB1残留量随AFB1解毒酶剂量的增加而降低得结果一致。这主要是霉菌毒素生物降解剂有效裂解AFB1双呋喃环的89双键,使双键打开而失去毒性,达到解毒的目的[162]

4 结论

(1) 黄河鲤鱼饲喂含50ppb AFB1的饲料后生长性能受到显著影响、生理生化指标异常

(2) 在含有50ppb AFB1的饲料中霉菌毒素生物降解的最佳添加剂量为1Kg/T,可明显改善黄河鲤鱼上述生理生化指标基本恢复或接近对照组的正常水平,在一定程度上消除了AFB1对黄河鲤鱼生理生化指标的不良影响。

 

章 本试验主要结论及有待进一步研究的问题

1 本试验的主要结论

(1) 黄河鲤鱼饲喂含50ppb AFB1的饲料后生长性能受到显著影响。在试验3060天时黄河鲤鱼AFB1组肝脏的颜色均为暗黑色,且在30天时肝体比较小,60天时肝体比较大。其中无论在30还是60天时黄河鲤鱼AFB1组的终末体重均较其它组低,但在饵料系数方面却最高。在存活率方面AFB1组最低,但40天以后基本趋于稳定。

(2) 50ppb AFB1的饲料饲喂黄河鲤鱼后,其血清中总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶的抗氧化活性降低;相反血清中丙二醛的含量则呈现升高的特征。

(3)含 50ppb AFB1的饲料可导致黄河鲤鱼免疫指标异常:脾脏指数、溶菌酶LSZ碱性磷酸酶降低

(4)50ppb AFB1的饲料可导致黄河鲤鱼鲤鱼肠道和肝胰脏蛋白酶活性、淀粉酶活性和脂肪酶活性在一定程度均有所降低。

(5) 50ppb AFB1的饲料可导致黄河鲤鱼消化道大肠杆菌和致病性弧菌增加,芽孢杆菌和乳酸杆菌减少。但对总需氧菌无明显影响。

(6) 50ppb AFB1的饲料可导致黄河鲤鱼肝脏和性腺中AFB1积累量增加。

    (7) 在含有50ppb AFB1的饲料中霉菌毒素生物降解的最佳添加剂量为1Kg/T,可明显改善黄河鲤鱼上述生理生化指标基本恢复或接近对照组的正常水平,在一定程度上消除了AFB1对黄河鲤鱼生理生化指标的不良影响。

2 有待进一步研究的问题

(1进一步研究水中添加霉菌毒素生物降解剂对黄河鲤鱼生长性能和生理指标的影响

(2进一步确定低含量AFB1的黄河鲤鱼饲料添加霉菌毒素生物降解剂最适添加量。

(3进一步研究霉菌毒素生物降解剂改善黄河鲤鱼性能的机理。

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